【背景】肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，肝癌）是成人肝脏恶性肿瘤中最常见的疾病，虽然肝癌的治疗技术不断提升，如手术切除、肝移植、放化疗，但肝癌患者总体5年生存率至今仍未明显改善。肝癌病死率高、预后差的重要原因之一就是肝癌发生发展的分子机制目前仍然知之甚少。然而，随着现代细胞分子生物学的进展，现已证明肝癌的形成多伴随一系列分子及信号通路的异常。因此，从分子水平探索肝癌发生发展的机制，并将特征性分子作为抗肿瘤靶点，可为临床预防和治疗肝癌开辟新的途径。长链非编码RNA（long non-coding，lncRNA）是近年来研究的热点，它是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA，无或很少具有蛋白质编码功能，曾被认为基因转录的“暗物质”，但目前发现lncRNA具有重要的生物学功能，如调控细胞增殖、细胞周期、细胞分化、细胞凋亡等。除此之外，lncRNA的异常表达与人类疾病密切相关，尤其在肿瘤方面。现已在乳腺癌、胃癌、肺癌、前列腺癌等多种肿瘤中发现lncRNA异常表达，且这些lncRNA主要参与肿瘤的发生、生长、浸润、转移及复发等过程，提示lncRNA在肿瘤的发生发展过程中可能起到癌基因或抑癌基因的作用。与既往研究较多的microRNA（miRNA）相比，lncRNA仍然属于一个相对未知领域。目前，lncRNA在肝癌中的研究仍较少，即使发现了几种与肝癌相关的lncRNA，但仍只是冰山一角，且部分lncRNA具体功能不清，绝大数lncRNA分子调控机制不明确，因此仍有必要继续寻找与肝癌相关异常表达的lncRNA，并探索其功能，进一步挖掘其分子生物学机制，从而更加完善肝癌的分子基础研究。本课题应用lncRNA芯片检测正常肝细胞及肝癌细胞系中lncRNA表达谱的差异，初步筛选出与肝癌相关的lncRNA，并进一步探讨lncRNA在肝癌中的作用及机制，为将来深入研究lncRNA打下基础。【目的】利用基因芯片技术筛选差异表达的lncRNA并确定一个新的lncRNA，命名为URHC（up-regulated in hepatocellular carcinoma），探讨URHC在肝癌细胞中的生物学功能及其分子调控机制，进而从新的角度阐明肝癌发生发展的机制，为日后临床分子治疗肝癌提供理论依据。【方法】1、利用lncRNA表达谱芯片检测并比较HepG2、SMMC7721、Huh7等3种肝癌细胞系与正常肝细胞系HL-7702的lncRNA表达情况，从表达水平、lncRNA长度、数据库完整lncRNA序列、GO富集及KEGG pathway分析等方面筛选与肝癌相关的差异表达的lncRNA，利用实时定量PCR（qRT-PCR）在肝癌细胞系和组织中验证部分差异表达的lncRNA，最后确定URHC为后续研究对象。2、收集52例行肝癌切除术患者的肝癌组织和对应的癌旁组织，采用qRT-PCR方法检测URHC表达，并分析URHC表达与患者临床病理特征及预后的关系。3、URHC的体外功能研究：选用高水平表达URHC的肝癌细胞系SMMC7721作为研究对象，转染URHC特异性siRNA抑制URHC表达水平，体外分别利用MTT、EdU、细胞周期、平板克隆形成、细胞凋亡、Western-blot、Transwell等实验观察其对肝癌细胞增殖、凋亡、侵袭及转移等生物学行为的影响。4、URHC靶基因的预测、验证及功能研究：结合基因定位分析和生物信息预测，推测ZAK可能是URHC的潜在靶点之一；qRT-PCR检测ZAK在肝癌组织中的表达情况，并利用qRT-PCR和Western-blot验证URHC与ZAK之间的表达关系；SMMC7721细胞分别转染URHC-siRNA、ZAK-siRNA、共转染ZAK-siRNA与URHC-siRNA，利用MTT、细胞周期及Western-blot等方法探索URHC是否通过ZAK发挥作用。5、URHC调控的分子机制研究：利用Western-blot检测MAPK通路重要蛋白的活化水平，并利用蛋白磷酸酶抑制剂PD98059和功能实验对ERK/MAPK通路进行验证。【结果】1、与正常肝细胞相比，我们选取在3种肝癌细胞系中同时高或低水平表达且2倍以上变化的lncRNA，认为其差异表达有意义。采用聚类分析，发现总共有1658个lncRNA差异表达，占所有lncRNA的3.9%，其中2倍以上共有477个lncRNA同时上调，2倍以上共有1181个lncRNA同时下调；5倍以上同时上调56个，5倍以上同时下调131个。这些差异表达的lncRNA与细胞代谢、细胞凋亡、细胞周期等相关基因有关，部分还可能参与MAPK、JAK-STAT、Wnt等信号通路调节。2、通过基因芯片和组织筛选，我们发现了一个新的lncRNA URHC，其在3种肝癌细胞系中均高表达，经qRT-PCR验证，lncRNA URHC在肝癌细胞和肝癌组织中同时上调表达，符合基因芯片结果。URHC在57.7%（30/52）的肝癌组织中高表达，URHC表达与肿瘤的体积（χ2=8.868，P=0.003）与肿瘤数目（χ2=6.857，P=0.009）显著相关，而与年龄、性别、AFP水平、肿瘤转移、门静脉癌栓、组织分化及AJCC分期等特征无明显相关（P＞0.05），Kaplan-Meier分析示URHC高表达与患者低生存率有关（χ2=4.863，P=0.027）。3、qRT-PCR结果示siRNA干扰后URHC表达下调；MTT、EdU结果表明较对照组，下调URHC表达显著降低细胞增殖能力；细胞周期结果表明URHC表达抑制后G0/G1期细胞显著增多，而S期细胞显著降低；平板克隆形成实验表明，抑制URHC表达后细胞克隆形成数目较对照组显著减少；流式细胞术显示抑制URHC表达后细胞凋亡率显著高于对照组；Western-blot示URHC表达下调显著增加了促凋亡蛋白Bax的表达，提高Bax/Bcl-2之间的比例；除此之外，URHC表达下调后，cleaved caspase3蛋白表达上调，且cleaved caspase3/caspase3比例显著升高，以上表明下调URHC表达能有效抑制肝癌细胞增殖并促进凋亡；Transwell实验表明抑制URHC表达对细胞的侵袭及迁移能力没有影响。4、基因定位分析发现ZAK位于URHC基因附近，提示URHC可能以cis-acting作用方式调控其表达；qRT-PCR发现ZAK在肝癌组织中显著低表达，且肝癌组织中URHC与ZAK表达呈负相关，URHC表达抑制后ZAK在mRNA水平和蛋白水平均表达上调，提示ZAK可能是URHC作用的潜在靶基因，且URHC通过负调控ZAK表达发挥作用。MTT示干涉URHC表达抑制肝癌细胞增殖的能力可以部分被下调ZAK表达所削弱；细胞周期结果表明ZAK下调减少了URHC下调所致G0/G1期细胞量的增加水平。Western-blot示ZAK表达下调降低了Bax蛋白及cleaved caspase3蛋白水平，表明ZAK下调与凋亡抑制有关，且抑制ZAK表达可部分逆转URHC抑制所介导的细胞凋亡能力。以上表明，URHC通过抑制ZAK表达促进细胞增殖及抑制细胞凋亡。5、Western-blot示URHC表达下调后ERK1/2、JNK及p38的磷酸化水平显著上调，而ZAK与URHC表达同时抑制减弱了ERK1/2、JNK及p38的磷酸化水平，但高于单纯ZAK表达抑制，说明下调URHC表达可促进ZAK表达并激活MAPK通路。后续的细胞功能实验表明PD98059能部分逆转URHC下调所致的抑制细胞增殖作用，且削弱了URHC下调介导的促细胞凋亡能力。以上结果说明URHC发挥促增殖、抑凋亡是通过抑制ZAK表达，并失活下游ERK/MAPK通路来实现的。【结论】1、我们发现并鉴定了一个新的lncRNA URHC，其在肝癌细胞及肝癌组织中均高表达，URHC的表达与肝癌患者的病理特征相关，且可预测肝癌患者预后。2、下调URHC表达抑制肝癌细胞增殖并促进凋亡，但对肝癌细胞侵袭及迁移无明显影响，提示URHC可能主要通过促进肿瘤的恶性生长发挥作用。3、URHC通过负调控靶基因ZAK表达，并使下游ERK/MAPK通路失活进而促进肝癌细胞增殖及抑制凋亡。因此，肝癌中可能存在URHC-ZAK-ERK/MAPK的调控机制，通过影响细胞增殖与凋亡促进肝癌的发生发展，这将为日后深入研究肝癌分子机制及临床分子治疗肝癌提供新思路。