间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）是骨髓中除造血干细胞外另一重要的干细胞。MSCs具有自我更新和多向分化能力的特点，它可以分化为多种骨髓基质细胞如脂肪细胞、成骨细胞和内皮细胞等；在一定的诱导体系中还能被诱导分化为软骨细胞、肌细胞、心肌细胞和神经元等。因此，MSCs对于受损组织的修复具有重要意义。另外MSCs还具有免疫调控和支持造血的能力，而且来源广泛，容易在体外培养和扩增，正是因为这些特点，MSCs目前已经应用于临床并显示了良好的治疗效果。但是，许多关键问题如免疫调控的具体机制、骨髓微环境对MSCs特性的影响等问题并未解决，所以，建立一种方便、快捷、有效地体外分离培养扩增MSCs的方法能为后续的研究奠定良好的基础。本实验应用一种新的方法——骨髓加骨片法分离培养小鼠MSCs。通过将骨髓加骨片法与现有的全骨髓贴壁法和骨片消化法对比，发现这种新方法出现的MSCs集落时间最早，集落数最多，获得的细胞数也最多；细胞呈梭形贴壁生长，流式细胞术检测结果显示细胞高表达干细胞标志之一Sca-1，高表达CD44、CD29，不表达白细胞表面抗原CD45和内皮细胞标志CD31；得到的MSCs在成骨诱导体系和成脂诱导体系中能分别向成骨细胞和脂肪细胞分化，具有典型的MSCs特性。由于MSCs上述多种优越的特性，尤其是对许多组织的损伤修复能力，使得MSCs各方面功能的研究成为热点，而MSCs又是骨髓微环境中的一种重要的干细胞，虽然它对骨髓微环境中其它细胞有重要作用如支持造血等，但其本身特性也会受到骨髓微环境的影响，当机体年老时，损伤修复过程中MSCs的动员和迁移就比年轻机体要慢，所以本研究着重探讨年轻骨髓和年老骨髓对MSCs迁移和增殖的影响。通过年轻骨髓和年老骨髓与骨片共培养，发现年老骨髓有抑制MSCs集落形成的作用。为了分析骨髓细胞中何种成分发挥作用，流式细胞术检测年轻骨髓和年老骨髓细胞结果显示B220+细胞在年老骨髓中所占比例明显低于在年轻骨髓中的比例，而CD11b+、CD3+、Gr-1+和F4/80+细胞则是在年老骨髓中所占比例明显高于在年轻骨髓中的比例。用磁珠分选年老骨髓中CD11b+、B220+、Ter119+细胞并分别与骨片共培养，发现这三个亚群并不能抑制MSCs集落形成。在增殖实验中，年老骨髓也并没有起到明显的抑制细胞增殖的作用，但是在划痕损伤修复实验和迁移实验中，年老骨髓作用的MSCs的迁移能力要弱于年轻骨髓作用的MSCs，进一步的QPCR结果显示年轻骨髓刺激后的MSCs表达SDF-1水平显著高于年老骨髓刺激后。另外western blot结果显示在年轻骨髓或是年老骨髓刺激下，MSCs的MAPK通路均被激活，但是p-38和ERK的磷酸化水平基本没有差异，而JNK磷酸化水平则是年轻骨髓刺激后的MSCs表达高。综上所述，骨髓加骨片法是一种方便、快捷、有效的小鼠骨髓MSCs分离方法；年老骨髓微环境具有抑制MSCs从干细胞龛中迁出的作用，但是具体是骨髓中哪部分细胞、细胞外基质或是细胞因子起作用还有待进一步研究。