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在各种非放免疫分析方法中，化学发光免疫分析（CLIA）具有灵敏度高、检测范围宽、精密度好、标记物稳定、可实现全自动化、应用范围广等优点，CLIA是一种先进的免疫分析方法。以吖啶酯衍生物为发光标记物的CLIA的特点是：标记简单、标记物稳定、不需要催化剂、自然本底低、受外界干扰因素少、信噪比高、发光体系简单等。 目前国内尚未见有关DMAE·NHS的合成及其应用于CLIA的研究报导，本论文研究了吖啶酯DMAE·NHS的有机合成方法，DMAE·NHS的发光性能，DMAE·NHS及其与抗体偶联物的热稳定性，DMAE·NHS标记TSH单克隆抗体和链亲和素，TSH CLIA，TSH BAS-CLIA和TT4 BAS-CLIA。 DMAE·NHS的合成是本论文的关键和难点，我们对文献方法进行改进：文献方法用氢氧化钠与3,5-二甲基-4-羟基苯甲酸反应制得3,5-甲基-4-羟基苯甲酸钠，再用3,5-二甲基-4-羟基苯甲酸钠与苄氯作用制备3,5-二甲基-4-羟基苯甲酸苄酯，我们用氢氧化钾代替氢氧化钠，使合成取得成功；在合成2’,6’-二甲基-4’-（N-琥珀酰亚胺氧羰基）苯基-吖啶-9-甲酸酯时，文献方法对粗产品进行两次硅胶柱层析纯化，第一次柱层析用氯仿/乙酸乙酯（4：1，Ⅴ：Ⅴ）作溶剂和淋洗剂，第二次柱层析用己烷/丙酮（2：1，Ⅴ：Ⅴ）作溶剂和淋洗剂，按照文献方法得到的不是所需要的化合物，我们只进行第一次柱层析纯化，然后用己烷/丙酮（2：1，Ⅴ：Ⅴ）进行研磨，过滤，洗涤，除去溶于己烷/丙酮（2：1，Ⅴ：Ⅴ）的部分，得到所需要的产品。合成产物经IR、1HNMR、MS和元素分析表征为所期望的化合物。 对DMAE·NHS发光性能的研究表明，DMAE·NHS的发光为闪光，0.4s时发光强度达到最大，发光半衰期约为0.9s，发光强度为6.11×1018cps/mol。发光启动试剂的组成对其发光强度有影响，表面活性剂如CTAC，TritonX-100，Tween-20等能增强其发光。DMAE·NHS与抗体偶联物DMAE·NHS-Ab的发光性能与DMAE·NHS相似，DMAE·NHS与Ab的分子比为2.4时其发光强度为1.8×1019cps/molAb。DMAE·NHS及DMAE·NHS-Ab具有良好的热稳定性，4℃或冰冻下，在pH7.0的PB缓冲液中，半年后它们的发光活性或免疫活性基本没有 中国原子能科学研究院博士学位论文 下降，室温或37’C下，由于水解而降低发光活性，它们的热稳定性随温度升高＿ 而降低，随熔液pH值增大DMAE佣S的热稳定性降低，而DMAE棚S－Ah在 中性溶液中最稳定。 以 DMAE·NHS为发光标记物，研究建立了两种 TSH CLIA方法，均采用一 步夹心免疫分析法，在第一种方法中一株抗TSH单克隆抗体包被微孔板，另一 株标记DMAE·N’HS，方法的分析灵敏度为0．olmIUA，批内变异系数为 4．29巧．71％，批间变异系数为 4．36ed．14％，平均回收率为 98％，与 TSH IRMA法 的相关方程为 Y－0．20＋0．92X，相关系数为 0．993，与 Ciba Co讪ng TSH CLIA测 量值的相关方程为 Y—0．16＋0．92兄相关系数为 0．986。在第二种方法中，引入 生物素－链亲和素放大系统①AS)，该方法用到的两株TSH单抗，一株包被微孔 板，另一株标记生物素，DMAE·NHS标记链亲和素，该方法亦具有良好的精密 性和准确性，与 TSH IRMA及 Ciba Co而flg TSH CLIA测量值呈明显相关，其分 析灵敏度较第一种方法高，为0刀07mIU／l，这两种方法之间亦相关良好。论文最．后对TT CLIA方法进行了研究，并初步建立起T乙 BAS－CLIA方法，该方法＿用T4单抗包被微孔板，T4ESA标记生物素，DMAE·NHS标记链亲和素，采用 8 。一步法竞争免疫分析。 ，研究结果表明：DMAE·NHS具有良好的发光性能，易与抗体偶联，偶联物 稳定，发光体系简单，是一种理想的化学发光免疫分析标记物，以DMAE·NHS 做发光标记物建立的 TSH CLIA、TSH BAS－CLIA和 TT4 BAS－CLIA方法，标准 曲线线性好、信噪比高、检测范围宽、具有较高的灵敏度，良好的精密度、准确 性和健全性，与 IRMA方法及 Ciba Coming CLIA的临床测量值相关性良好。