用方便易得、可再生的木质纤维素原料生产生物燃料和其他高附加值产品是目前研究的热点。预处理过程可以破坏纤维素、半纤维素、木质素的交联,促进纤维素酶对纤维素的水解,释放单糖,是必不可少的过程。然而在这一过程中会产生一系列抑制微生物生长及后续发酵过程的毒性物质。这些物质主要包括弱酸类、呋喃类和酚类化合物。在这些抑制物中,酚类抑制物的毒性最强,其毒性的强弱依赖于功能基团和分子量的大小。香草醛属于低分子量的愈创木基酚类,其在很低的浓度下即可抑制细胞的活性。酿酒酵母具有良好的发酵性能,对乙醇的耐受性很高,遗传操作简单,被认为是最有潜力的生物燃料生产菌株。本实验室前期对一株二倍体工业菌株NAN-27先后进行EMS诱变和在水解液中的适应性驯化,获得的菌株中有一株表现出高香草醛耐受性特征,命名为EMV-8。对这两株菌株进行了基因组测序并比较其差异。结果显示,相对于NAN-27的基因组,在EMV-8的基因编码区发生了 450个非同义单核苷酸突变(SNPs),使275个基因所编码的蛋白序列发生了改变;另有44个基因发生了插入缺失突变(InDels)。本论文从275个由非同义单核苷酸突变引起的所编码蛋白序列发生改变的基因中分选出编码氧化还原酶的基因、响应氧化胁迫和参与DNA修复的基因作为研究对象,从中鉴定出与香草醛耐受性相关的基因,并对这些基因具体的分子机制进行解析。本文主要研究结果:(1)香草醛耐受性相关基因的初步筛选我们首先对选取的三类基因共19个进行PCR以及Sanger测序,确定其中15个确实发生突变的基因。继而在实验室菌株BY4741中敲除这些基因,并利用点滴平板生长实验测试其在香草醛胁迫条件下和非胁迫条件下的生长情况。结果表明四个敲除菌株 BY4741(gcy1Δ),BY4741(mbf1Δ),BY4741(msn1Δ)和BY4741(wtm2Δ)在YPD平板上与对照菌株BY4741具有相似的生长表型,而在含有香草醛的平板上的生长比对照菌株慢。这表明这些菌株对香草醛更加敏感。因此,这些基因可能与香草醛的耐受性相关。之后,我们在相应的敲除菌株中,分别过表达上述四个基因的野生型和突变型,并以转有空载体pJFE3的实验室菌株BY4741为对照菌株,在含有香草醛的液体培养基中评估过表达的基因及其点突变对菌株香草醛耐受性的影响。发酵结果表明,在含有6 mmol L-1香草醛的液体培养基中,GCY1WT和GCY1A181E过表达菌株的最大比生长速率分别比对照菌株BY4741(pJFE3)提高了 49%和54%,香草醛还原速率分别比对照菌株提高了36%和34%,其旁系同源物YPR1过表达菌株的最大比生长速率比对照菌株BY4741(pJFE3)提高了 28%,香草醛还原速率比对照菌株提高了 30%。MBF1 WT和MBF1P148L过表达菌株的最大比生长速率分别比对照菌株BY4741(pJFE3)提高了 48%和44%,但没有提高菌株的香草醛还原速率。但是,GCY1WT和GCY1A181E,MBF1WT和MBF1P148L过表达菌株分别具有相似的生长表型,表明这两个点突变对相应蛋白和香草醛耐受性相关的功能没有明显的影响。此外,过表达MSN1 WT和MSN1S171P/P190Q,WTM2WT和WTM2Q8L分别不能回补msn1Δ菌株和wtm2Δ菌株的香草醛敏感表型。(2)过表达GCY1提高酿酒酵母香草醛耐受性的机制研究过表达GCY1提高了菌株的香草醛还原速率,表明Gcy1p可能具有香草醛还原活性或者为这一还原反应提供辅酶。首先我们测定了经细胞破碎得到的无细胞提取物的香草醛还原活性,测定结果表明Gcy1p具有NADPH依赖性的香草醛还原活性。此外,其旁系同源物Ypr1p被证明具有NADH和NADPH依赖性的香草醛还原活性。随后测定GCY1过表达菌株和对照菌株的胞内辅酶水平,结果表明过表达GCY1并不影响菌株的[NAD(P)H]/[NAD(P)+]。因此,作为还原酶,直接将香草醛还原为毒性很低的香草醇是Gcy1p提高菌株香草醛耐受性的机制之一。继而,我们把Gcy1p的活性中心第56位酪氨酸(Y)突变为苯丙氨酸(F)后,废除了 Gcy1p的香草醛还原活性。但是过表达GCY1 Y56F的突变菌株香草醛耐受性仍高于对照菌株,表明Gcy1p可能有其他方面的功能与香草醛的耐受性相关。文献报道,Gcy1p具有mRNA结合活性,可以结合44个基因所编码的mRNA。根据已报道的香草醛解毒的机制,我们研究了其中三大类基因与香草醛耐受性之间的关系。其中,提高编码核糖体蛋白的基因和参与染色体重构的基因的表达水平不影响菌株的香草醛耐受性;而提高参与过氧化物酶体组装的蛋白Pex5p和参与过氧化物酶体自噬和囊泡转运的蛋白Trs85p的表达水平能够影响菌株对香草醛的耐受性。因此推测,通过结合PEX5与TRS85的mRNA并影响这些基因的表达水平是Gcy1p提高菌株香草醛耐受性的另一机制。之后,荧光定量PCR测定结果表明过表达GCY1并未影响PEX5与TRS85的mRNA水平。Gcy1p对PEX5与TRS85的影响方式目前还在研究中。(3)过表达MBF1提高酿酒酵母香草醛耐受性的机制研究Mbf1p是转录辅激活因子,可以桥接TATA结合蛋白(TBP)和一些转录因子的结合,增强下游基因的表达。Mbf1p的第112位天冬氨酸是Mbf1p与TBP结合的关键氨基酸。文献报道把天冬氨酸(D)突变为丙氨酸(A)可以大幅度降低Mbf1p与TBP的结合能力并影响下游基因的表达水平。我们的研究结果显示,过表达MBF1D112A和MBF1P148L/D112A突变子的菌株和过表达MBF1WT和MBF1P148L的菌株在含有6 mmol L-1香草醛的液体培养基中具有相似的生长表型。这表明Mbflp可能不通过桥接TBP影响菌株的香草醛耐受性。综上所述,本论文以实验室前期基因组测序为线索,发现过表达GCY1和MBF1可以提高菌株的香草醛耐受性,相应的点突变并不影响菌株的香草醛耐受性。对这两个基因影响菌株的香草醛耐受性机制的研究结果表明,Gcy1p一方面作为香草醛还原酶直接还原香草醛,另一方面可能通过结合PEX5与TRS85的mRNA调控过氧化物酶体的组装、过氧化物酶体的自噬和囊泡转运过程影响菌株的香草醛耐受性。Mbflp也对菌株香草醛耐受性有正向影响,但这一影响并不通过桥接TBP完成。