对叶百部来源于百部科(Stemonaceae)百部属(Stemona)植物对叶百部Stemona tuberosa Lour.,为《中华人民共和国药典》(2005、2010年版)所收载百部药材的3个来源品种之一,为中医临床常用中药,内服止咳,外用杀虫,应用广泛。课题组所在地广西,以及广西周边省份(云南、贵州、湖南、广东)为对叶百部主要产地。本研究从百部的本草考证、对叶百部的资源及商品调查、生药鉴定、质量评价、总生物碱指纹图谱特征与其止咳药效学关系研究等几方面进行质量评价研究。一、本草考证百部药材始以“百部根”一名出现,本草记载的“百部”、“百部根”二名常混用或通用；“百部(根)”为正名,以块根的数量和排列特征命名,历代本草记载一致的,其他名称均作为别名记载；“白并”并非“百部”别名。本草记载百部植物来源主要为直立百部、对叶百部、蔓生百部及百合科天门冬属的植物。药用百部应以现行《中国人民共和国药典》收载的品种为主。百部分布于秦岭以南各省区,对叶百部分布区域较直立百部偏南,广西及其周边省份、越南均为对叶百部药材主产区。二、资源及商品调查通过查阅相关文献和标本,咨询专家并进行实地考察,整理出对叶百部在全国、在广西的分布及其主要产地,确定其主产于长江流域以南各省区,基本野生,一般分布在深山,GPS定位显示所采样品海拔分布为35～1577 m,发现低海拔也有对叶百部分布。广西及其周边省份百部商品药材来源基本为对叶百部,为大宗药材,广西主产地为百色、河池、桂林等地,尚有越南进口。各大药市均有百部销售,其中对叶百部(大百部)居多。三、生药鉴定(1)性状鉴定根具浅纵皱纹或不规则纵槽,中柱较大。茎类圆形,两侧向内凹陷呈深沟状,节稍膨大。叶广卵形,叶脉7-15条。(2)显微鉴定根被细胞约3列,第1列细胞壁加厚；中柱韧皮部束和木质部束各25～30个,相间排列；具髓部,较宽。茎中柱维管束为周木型,大小相间排列成环。叶主脉维管束类椭圆形,具环状维管束鞘；叶肉内草酸钙柱晶散在；粉末中气孔为不定式,导管多为螺纹导管,纤维呈长梭状。(3)理化鉴定碘化铋钾、硅钨酸实验：根、茎、叶药材均为正反应。以上特征可为对叶百部根、茎、叶的生药鉴定提供参考依据。另外,本研究观察到对叶百部茎的中柱维管束为周木型。四、化学成分系统预试验及氧化对叶百部碱制备(1)系统预实验实验结果初步表明：对叶百部根、茎、叶所含成分基本一致,均可能含有氨基酸、多肽、蛋白质、糖、多糖、苷类、有机酸、酚类、香豆素、内酯、生物碱等化学成分。(2)氧化对叶百部碱制备经分析测试,广西及其周边省份几个主要产地的对叶百部药材中未检测到对叶百部碱；采用制备液相从对叶百部总生物碱部位分离得到1个高含量的共有化合物,经过EI-MS、13C NMR、1H NMR等多种方法测定,推断其结构为氧化对叶百部碱(oxotuberostemonine)。五、质量评价(1)总生物碱含量测定采用酸性染料比色法进行总生物碱含量测定,含量范围为6.56～23.56 mg/g,相差3倍以上,说明不同来源对叶百部的质量存在较大的差异。平均含量为15.41 mg/g,当地自采的样品中广西上思(20.93 mg/g)、广西凤山(19.40mg/g)、广东信宜(18.35 mg/g)含量较高。该方法使用简便、快速、灵敏。(2)氧化对叶百部碱含量测定采用甲醇超声提取、HPLC法测定氧化对叶百部碱的含量,含量范围为0.69～5.83 mg/g,相差8倍以上,说明不同来源对叶百部的质量存在较大的差异。平均含量2.40 mg/g,其中广西大新(5.83 mg/g)、广西靖西(4.89 mg/g)和广西恭城(4.24 mg/g)含量较高。该方法简便易行、结果准确,可在一定程度上反映对叶百部药材的质量,可考虑作为对叶百部药材质量评价的方法。(3)TLC研究初步建立了以氧化对叶百部碱为对照品的对叶百部药材TLC鉴别方法：制备总生物碱,以氯仿：甲醇(20：1)展开,改良碘化铋钾显色。TLC显示16批药材样品的供试品色谱中,在与对照品色谱相应位置上显相同颜色的棕红色斑点。此方法简单、快捷,专属性较强,为对叶百部药材的质量评价提供了实验依据。另外,TLC显示各个样品斑点多少不一,对应斑点强度也有差异,印证了对叶百部种内成分差异明显。(4)检查①16批药材样品水溶性性浸出物含量测定结果显示：总平均值68.51%,单个样品平均值最高值为80.89%,最低值为53.41%,所测样品水溶性浸出物含量均超过药典规定(不得少于50.0%)。②16批药材样品水分、总灰分、酸不溶性灰分含量总平均值分别为7.85%、5.82%、0.92%。单个样品平均值最高值和最低值分别为：水分为11.25%和5.58%；总灰分为10.55%和3.61%、酸不溶性灰分为2.48%和0.36%,均相差1倍以上,说明不同来源对叶百部的质量存在较大的差异。六、总生物碱指纹图谱特征与其止咳药效关系的研究(1)指纹图谱的构建以氧化对叶百部碱的色谱峰作为参照峰,建立了对叶百部总生物碱的HPLC指纹图谱：检测波长为230 nm,以乙腈：0.05%三乙胺磷酸水溶液为流动相梯度洗脱,在85 min内记录药材的指纹图谱。本研究建立的色谱方法可以使不同来源对叶百部药材总生物碱具有基本一致的色谱行为,但也可以从色谱图特征峰很直观看出对叶百部药材种内成分及其含量差异明显。由此,HPLC指纹图谱只标定了6个共有特征峰,16批药材样品总生物碱HPLC图谱有6批相似度大于0.8。(2) HPLC指纹特征的聚类分析研究以对叶百部总生物碱HPLC指纹图谱色谱峰的峰面积为量化特征,用SPSS16.0统计软件进行系统聚类分析：16批药材样品分成4类,在一定程度上反映了样品间距离、生境的联系。(3)止咳作用研究在传统氨水引咳方法的基础上,采用序贯试验方法研究不同来源药材样品总生物碱的止咳作用,结果显示：均能延长氨水引咳时间(R值>100%)；各组样品的止咳作用差异明显,其中广西恭城、广西凤山、广西靖西组均有显著止咳作用,强于阳性对照组可待因。(4)指纹图谱特征与其止咳药效指标灰关联度分析在获得对叶百部总生物碱指纹图谱与药效学量化数据的基础上,采用灰关联度分析技术,确定指纹图谱特征所代表的化学成分对止咳作用贡献的大小。实验结果显示：关联度集中分布在0.53～0.84之间,居中,说明指纹图谱特征所代表的化学成分贡献接近,因此推断其止咳药效是总生物碱“化学成分群”共同起作用的结果；指纹图谱共有峰(含氧化对叶百部碱)对止咳药效的贡献比较大。七、质量评价指标相关性分析把止咳药效评价指标及与其紧密相关的其它评价指标的数据集中起来,探讨各评价指标间一致性或者相关性,结果显示：不同来源样品的各评价指标的数据升降趋势并不一致,推测并不是其它评价指标数据越高,药效就相应越大,应该是多成分综合作用,而且肯定另有高活性成分在起作用。八、质量标准草案及起草说明依据本研究结果,结合《中华人民共和国药典》(2010年版)百部项下已有规定,初步制订了对叶百部药材质量标准草案及起草说明。