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本试验以东方百合“索蚌Sorbonne”、“元帅Acapulca”和亚洲百合“顶级High Class”为试材,进行了在露地和离体条件下百合自交和杂交的授粉试验、胚囊发育与双受精过程细胞学观察、原生质体培养几方面的研究。探讨了不同授粉方法克服百合不亲和性的效果、离体授粉试验的条件方法、胚囊发育与双受精的时期、分离和培养原生质体的条件。
试验结果表明,无论是亲和组合还是不亲和组合,花粉都可以在柱头萌发,花粉管沿着花柱壁向下延伸,花粉管量是按照柱头,花柱,子房依次递减的。切割花柱授粉能克服百合的花柱不亲和性,通过离体授粉和子房切片结合的方式,可以克服索蚌自交在露地条件下授粉的不亲和性。无论是采用常规柱头授粉方式还是保留0.5花柱授粉方式,通过荧光染色观察花粉管生长情况,露地授粉的花粉管生长速度略快于离体情况,但两者差异不大。
通过八种正交试验培养基的培养及结果分析选择出有利于索蚌离体授粉子房培养的培养基配方:MS+NAA0.02 mg·L<-1>+糖8%+BA0.2 mg·L<-1>+氨基酸,或MS+NAA0.02mg·L<-1>+糖8%+BA2 mg·L<-1>+氨基酸。方差分析表明,影响最显著的因子是授粉方式,依次顺序为:糖、氨基酸、BA。从结种方面比较,索蚌自交离体条件下授粉的子房经过子房切片培养、胚抢救的处理,最终得到7胚/子房,而在活体情况下子房在植株上栽培2个月后,并未得到有胚的种子。但百合远缘杂交授粉在离体和活体两种条件下都没有得到种子。
离体胚珠授粉试验中观察到,索蚌与顶级百合进行自交和正反交,其花粉都能正常进入胚珠的珠孔处,不亲和的障碍不存在于花粉穿入珠孔处。花粉最早在2h左右萌发,花粉管进入珠孔最早发生在3-5h最迟在8-12h,DAPI染色后荧光显微镜观察发现,最早生殖细胞分裂是培养13h后,13-17h花粉管分裂形成3核细胞最多的阶段,22h后大部分花粉管内的物质都已经释放出来。授粉的胚珠初期生长膨大,但培养50-60d后胚珠萎蔫,变黄,没有得到有胚的种子。
在观察胚囊发育,花粉管生长和双受精过程的试验中,百合大孢子的发育形式为贝母型,其胚囊发育最终形成育性正常的7细胞胚囊,-2级的胚囊已经发育成熟,适宜授粉受精。异花授粉后花粉管3-5天到达胚囊,并释放出两个精核进行双受精。百合胚胎发育经过合子、原胚、球形胚、子叶型最终发育成熟。胚乳发育与胚胎同步,其属于核型胚乳,在形成球形胚后胚乳细胞逐渐形成细胞壁。授粉后45天左右进行胚抢救较好。
本试验还对百合原生质体的分离和培养进行研究,用混合酶液提取“索蚌”百合的幼叶和愈伤组织的原生质体,对影响原生质体提取得率因素进行分析,用液体浅层培养法和固液结合培养在MS、改良MS和NLN培养基附加不同浓度6-BA,2,4-D等进行培养。试验结果表明:纤维素酶和酶解时间对原生质体提取得率有极显著影响,最适合百合幼叶原生质体提取的酶液组合为:2%Cellulase R-10,0.5%MacerozymeR-10,酶解4h。百合愈伤组织的原生质体提取的酶液混合液组合为:2%Cellulase R-10+0.5%MacerozymeR-10+0.05%PectolyaseY23+147mg·L<-1>CaCI<,2>·2H<,2>O+976mg·L<-1>MES+0.6MSorbitol。进行原生质体的培养仅愈伤组织为来源的观察到细胞的分裂,幼叶为来源的原生质体几乎没有分裂,但两者最终都没有形成愈伤组织。