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水牛成熟卵母细胞结构复杂,玻璃化冷冻期间细胞结构以及理化性质易发生变化,引起纺锤体微管的紊乱,进而影响染色体的分布,同时破坏微丝结构。研究表明,细胞骨架稳定剂可以减弱细胞骨架在冷冻期间的损伤。本试验将探讨冷冻前细胞松弛素B(CB)预处理水牛体外成熟卵母细胞对其玻璃化冷冻保存效果的影响,进一步了解玻璃化冷冻的损伤机制,为改善水牛卵母细胞冷冻效果指引方向。第一章：研究水牛成熟卵母细胞玻璃化冷冻前CB处理浓度的优化。水牛成熟卵母细胞在玻璃化冷冻前分别在含有0 μg/mL、4 μg/mL、8 u g/mL、12μg/mL CB的工VM培养液中孵育30 min。结果表明,与新鲜的对照组相比,玻璃化冷冻均造成卵母细胞存活率、卵裂率、囊胚率的下降(P<0.01)。但是冷冻前8 μ g/mL组的预处理能够提高冻融后卵母细胞卵裂率和囊胚率,与0 μ g/mL组的相比差异显著(69.18% vs 43.89%,17.28% vs 10.27%, P<0.05),而4 μg/mL组和12μg/mL组的预处理作用效果不明显。因此选用8 μg/mL CB进行后续实验。第二章：研究用CB预处理后玻璃化冷冻对水牛成熟卵母细胞的细胞骨架结构和骨架蛋白的影响。结果发现,成熟卵母细胞的微管富集在极体处以及以纺锤体形式分布在染色体周围,呈垂直或者平行的状态,而微丝主要聚集在极体处。水牛成熟卵母细胞在玻璃化冷冻前经8 μg/mL的CB预处理,可提高冻融后纺锤体微管结构、染色体形态与微丝分布正常率,较未处理冷冻组差异显著(48.99% vs 38.66%,52.14% vs 42.11%,54.59% vs 43.54%, P<0.05),但均明显低于新鲜组(70.57%,77.03%,81.47%,P<0.01)和新鲜CB处理组(74.72%,76.76%,80.60%,P<0.01)。此外,对冻融后卵母细胞微管蛋白和肌动蛋白的含量进行分析。结果表明,经8 μg/mL CB预处理,水牛成熟卵母细胞冻融后微管蛋白的含量显著高于未处理冷冻组(P<0.01),但肌动蛋白的含量在冷冻前后没有显著差异(P>0.05)。第三章：探索CB预处理水牛成熟卵母细胞对其冻融后发育潜能的影响。对冻融后水牛卵母细胞进行胞浆内单精子注射和胚胎培养。结果表明,8μ g/mL CB预处理组的卵母细胞8-细胞卵裂率、囊胚率均显著高于未处理冷冻组(54.50% vs 34.90%,17.08% vs 10.21%, P<0.05),但冷冻中处理组与未处理组的第二极体排出率、2-细胞卵裂率、囊胚率均显著低于对照组(P<0.05)；对照组的囊胚细胞数虽稍高于两试验组,但差异不显著(84.0% vs 81.0% vs 74.4%, P>0.05)。上述实验结果表明：8 μg/mL CB预处理可提高水牛成熟卵母细胞玻璃化冷冻效果,主要体现在提高冻融后卵母细胞纺锤体微管结构、染色体形态、微丝分布正常率、微管蛋白的含量和后续的发育潜能。