论文部分内容阅读
毛白杨(Populus tomentosa Carr.)是我国特有的白杨派树种,是我国北方主要的行道树种和用材树种,具有速生、优质等特点并对美化环境,保持水土有重要的作用。但是,一方面,毛白杨的育种周期较长,有5-10年的童期;另一方面,在开花和结实季节,雄株会飞散花粉,雌株会产生白色的飞絮,这种情况不但污染了城市环境,而且给毛白杨的育种和推广工作带来了困难。因此,本文旨在通过分离毛白杨花发育关键的基因,并构建正反义表达载体和RNAi载体定向调控毛白杨的开花发育,为缩短育种周期、培育出高度不育的环保型毛白杨品种奠定基础。本文以毛白杨雄性无性系LM50和雌性无性系5082为研究对象,通过对其雌雄花芽形态发育规律的观察,建立了雌雄花芽的cDNA文库,研究了离体叶片再生条件、抗生素筛选条件以及根癌农杆菌介导的毛白杨遗传转化体系的优化,建立了高效的离体再生系统和遗传转化体系,并将从毛白杨中克隆的与开花相关的关键基因构建表达载体,分别转入模式植物烟草和毛白杨雌雄无性系中,对转基因烟草进行了分子检测及田间试验。主要的研究结果如下:1.定期采集两年内的毛白杨雌雄株花芽,石蜡连续切片,显微观察雌雄花芽器官分化,揭示了毛白杨雌雄花芽的分化规律和雄性不育的可能原因。2.以两年内采集的毛白杨雌雄花芽为材料,运用SMART[TM]cDNA文库构建的方法,分别构建了雌雄花芽的的cDNA文库。经测定,雌、雄毛白杨花芽文库的初始滴度分别为8.0×105和7.2×105 pfu/mL,扩增后滴度分别为2.60×108 pfu/mL、2.56×108 pfu/mL,重组率为90%,插入片段长度为0.4-2.5 kb,这些数据表明文库质量达到质控要求。3.根据毛果杨的AP3同源基因序列的保守区设计PCR引物,扩增出毛白杨开花关键基因PtAP3,序列分析表明,该基因全长1813 bp(包括引入的酶切位点),包括7个外显子和6个内含子,编码238个氨基酸。Southern杂交分析发现,该基因在毛白杨雄株中为双拷贝,而在雌株中则为单拷贝。4.建立了烟草和毛白杨雌雄无性系的再生和转化体系。比较了毛白杨无性系的叶片和茎段在不同时期、不同发育状态,不同部位的分化能力。确定了毛白杨叶片外植体不定芽诱导卡那霉素临界耐受浓度为20 mg/L,试管苗不定根耐受浓度为25mg/L。同时比较了头孢霉素(Cef)和羧苄青霉素(Cb)对烟草和毛白杨不定芽和不定根诱导的影响及对农杆菌菌株的抑菌效果,结果表明,Cef对LBA4404和GV3101的抑菌效果比Cb好,适宜浓度为200-300 mg/L,生根时为200-600 mg/L。筛选出最佳烟草叶片分化不定芽的培养基为MS+6-BAl.0 mg/L+NAA0.1 mg/L;最佳毛白杨叶片分化不定芽的培养基为MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.1 mg/L,不定芽生根培养基为1/2MS+NAA0.3 mg/L。5.将毛白杨PtAP3基因和PtLFY基因融合CaMV35S启动子的pBll21质粒构建植物正反义表达载体和反向重复的RNAi载体,转入烟草,对筛选出的抗性植株进行PCR及PCR-Southem检测。结果表明,成功获得了转入PtAP3,PtLFY-IR和Ptap3基因的烟草植株。转基因烟草扩繁后移栽,在相同的条件下,转PtAP3基因的烟草与对照、反向重复PtLFY和反义Ptap3相比,具有明显的高生长优势,并且开花比对照提前一个月以上。反义Ptap3烟草和反向重复的PtLFY烟草开花均被抑制,未成花。收集对照及To代转PtAP3基因烟草的种子,播种,T1代,T2代表现稳定,均比对照生长旺盛,提前开花,说明转基因效果能够稳定遗传到下一个世代。6.选取毛白杨同龄同代的生根组培苗叶片作外植体,叶盘转化的最佳取材位置是自茎尖展叶始第1-3片叶;利用建立的遗传转化体系转化毛白杨雄性无性系LM50和雌性无性系5082,通过抗Kan筛选出转有毛白杨(LM50)正反义PtAP3和PtLFY-IR等基因的转基因植株,并进行了初步的PCR检测,结果表明已整合到毛白杨LM50的基因组中。目前移栽和进一步的检测工作正在进行。