研究背景与目的人类红细胞ABO血型系统是临床上最重要的血型系统。ABO的血型鉴定对临床输血安全和器官移植安全有着重要意义。ABO血型鉴定的传统方法主要是血清学方法,对A、B抗原进行鉴定,该类方法检测速度快,易于操作,价格低廉,但检测易受红细胞表面抗原活性、个体分泌状态以及微生物污染等因素的影响。自1990以来,血型基因被相继克隆,出现了基于DNA检测的ABO血型基因分型技术,极大的弥补了血清学方法的不足。但目前的人类红细胞血型基因分型的方法自动化程度不够高,不够灵活,速度慢,成本高,不适合中国人群使用。为此,建立一套全基因组自动核酸提取系统,同时采用不对称PCR-SSP技术和分子信标(molecular beacon,MB)检测技术,建立一种新的ABO人类红细胞血型基因分型技术具有重要的临床意义。目前发现的血型系统共有36个,其中常规检测的血型系统有2个。当输血时,患者被输入未检测到与本人血型系统不相合的血液制品,存在机体产生免疫性抗体的风险,特别是需要长期输血治疗镰刀性贫血,地中海贫血等疾病的患者。如果由于长期输入未检测血型系统的异型血就会产生相关抗体,最后导致无血可输。又如女性患者如输入异型血,可产生相应抗体,可导致新生儿溶血病或不孕不育症。因此,研制高通量的血型鉴定方法用于更广的稀有血型系统的检测迫在眉睫。本研究组扩展了前期建立的人类红细胞血型基因分型方法,建立起一种可同时检测Kell、Kidd、Duffy、Diego的高通量人类红细胞血型基因分型方法。研究方法本研究通过改进科室现有的汉密尔顿加样仪和赛默飞的核酸提取仪建立一套自动化全基因组核酸提取系统,对系统进行优化。验证提取系统对全血、白膜层和红细胞三种不同样本提取效果的比较,找到一种最佳的模式。通过NCBI查找ABO血型系统不同血型的SNP位点,针对查找位点设计不对称PCR-SSP引物,然后进行不对称PCR-SSP扩增,对扩增产物进行测序,针对扩增产物设计分子信标,然后将扩增好的产物加入已经准备好的每孔都有对应分子信标的黑色96孔检测板里,通过多功能酶标仪进行判读。最后通过研发设计编写人工智能软件,对酶标仪读取的结果进行分析,直接得出各样品的血型基因型。研究结果本研究针对不同液体性质采用不同的加样模式,有效地避免了样品之间的污染,避免了液体因模式不当引起的仪器挂珠,加样量不准等造成的结果误差。得到了提取纯度和浓度均高的全基因组核酸;本研究通过优化不对称PCR-SSP反应条件得到了单链靶标DNA;本研究通过优化分子信标检测条件,得到有显著差别的阴性结果和阳性结果,使得结果容易判别;本研究通过人工智能软件判读血型结果,使得快速准确地判读结果成为现实,避免了人为判读结果的繁琐和错误。采用此方法,96个测试可在5h内完成,该方法检测灵敏度低于n M,特异性为100%。结论本研究建立了一套目前国内高自动化、高通量、智能的人类红细胞血型基因分型技术,此技术可以检测ABO血型系统的A1、A2、O1、O2、B等位基因,可以检测21种ABO血型系统的血型基因型。该系统也可以灵活运用于检测如Kell、Kidd、Duffy、Diego等其他稀有血型系统。