Kurthia huakuii漆酶基因的克隆表达、蛋白纯化与酶学特性研究

来源 :中国农业科学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:may523
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漆酶由于能够催化氧化各种酚类和非酚类芳香化合物成水,漆酶被广泛用于合成染料的脱色和脱毒。Kurthia属菌株对三苯甲烷染料和纺织染料废水具有出色的脱色性能。根据Kurthia huakuii LAM0618T基因组注释的结果,并基于生物信息学的分析,本文克隆了一个类漆酶基因laclK,并对laclK的原核表达,重组LaclK的酶学特性及其在染料脱色方面开展了一系列研究。主要结论如下:  (1)成功构建了E.coli BL21(DE3)/pET28a-laclK表达菌株。  (2)通过IPTG、铜离子以及温度梯度诱导,确定了LaclK诱导表达的最优条件,为0.2 mM IPTG和0.5 mM Cu2+低温16℃诱导。咪唑梯度洗脱确定了重组LaclK最佳的洗脱浓度,为300 mM。  (3)结构性质:光谱学分析表明LaclK在610 nm和330 nm处未出现漆酶特征吸收峰。铜含量测定表明LaclK只含有1个铜离子。  (4)酶学特性:LaclK最适反应温度为65℃,60℃、pH2.5条件下保持6 d酶活无损失,80℃半衰期83 h。LaclK是发现最耐热的酚氧化酶类。LaclK能够催化常见漆酶底物ABTS、2,6-DMP和L-多巴胺。以ABTS、2,6-DMP、L-多巴胺为底物时最适pH分别为2.5、7.0和6.0。LaclK在酸性条件下和中性偏碱性条件下(pH2.0~9.0)都具有酶活,尤其在酸性条件下(pH2.5)具有很高的稳定性。铜离子对LaclK发挥酶活性是必要的,0.2 mM的Cu2+浓度使LaclK酶活达到最高。1 mmol的Mg2+, Pb2+, K+, Co2+和Ca2+能促进酶活,而1 mmol的Mn2+,Fe2+,Zn2+和Ag+对LaclK具有抑制作用。LaclK具有很好的有机试剂耐受能力,10%(v/v)的甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、曲拉通X-100和二甲基亚砜都能促进酶活。L-Cys、EDTA、DTT以及SDS是酶的强抑制剂。LaclK的催化常数Kcat与某些报道的多铜氧化酶很接近,但是比典型的细菌漆酶低了两个数量级左右。LaclK的结构特点和底物特异性表明LaclK为类漆酶多酚氧化酶。  (5)染料脱色:LaclK能够在中性偏碱性条件下脱色多种测试的染料,脱色性能优良,在介体ABTS参与下,60℃反应1 h,60 U/L的LaclK对25μM的维多利亚蓝B和乙基紫的脱色率分别达到92%和94%。此外,LaclK还拥有一定的卤化物和有机试剂耐受性,在染料废水的生物修复中具有一定的应用潜力。
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