【摘 要】
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目的1.左心室心肌致密化不全（Left ventricular noncompaction,LVNC）是一种具有突出的小梁网状结构和深的小梁隐窝模式为特征的心肌病,被认为是由于正常心内膜形态发生障碍所引发的疾病。对心肌发育起作用和调节胚胎心肌增生的基因仍然了解很少。14-3-3ε由YWHAE编码,是14-3-3蛋白的一个亚型。14-3-3ε是一个调节蛋白,在神经元发育中扮演着重要的角色,涉及到Mi
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目的1.左心室心肌致密化不全（Left ventricular noncompaction,LVNC）是一种具有突出的小梁网状结构和深的小梁隐窝模式为特征的心肌病,被认为是由于正常心内膜形态发生障碍所引发的疾病。对心肌发育起作用和调节胚胎心肌增生的基因仍然了解很少。14-3-3ε由YWHAE编码,是14-3-3蛋白的一个亚型。14-3-3ε是一个调节蛋白,在神经元发育中扮演着重要的角色,涉及到Miller-Dieker综合征（是一种以无脑回和特殊面容为特征的复杂综合症。本病是由于17p13.3处多个基因微缺失或点突变引起神经元迁移障碍、导致大脑皮层发育异常造成的。本病发病率约为1.2/10万,约90%的患者发现有17p13.3的微缺失）。缺乏这个基因的鼠发育成LVNC。因此,我们假设YWHAE变异体对人类LVNC病理生理起作用。TAZ（G4.5）是与Barth综合征和LVNC相关的最先被确认的基因。Barth综合征通常发生在婴儿,有扩张性心肌病或心内膜弹力纤维增生症、骨骼疾病、中性粒细胞减少症、生长迟缓、线粒体异常、胆固醇代谢异常、乳酸酸中毒和3-甲基戊烯二酸尿症、2-乙基羟基丙酸尿症,为X-连锁隐性遗传。本研究目的是筛查LVNC病人YWHAE基因和TAZ基因的致病变异体。材料和方法1.血样来自77个日本病人（YWHAE基因筛查）,包括29个家族病例（男17例,女12例）及48个散发病例（男33例,女15例）,在知情同意后,用Quick Gene DNA全血试剂盒提取基因组DNA。募集200个种族相匹配的正常对照,在知情同意后用上述方法提取DNA。本研究获得富山大学医院研究伦理委员会批准。PCR扩增后样本被纯化,按照ABI Big Dye终止子循环测序工序和ABI 310自动测序仪直接测序和分析。当一个假定的变异体被确定,还要对这个先证者的家族成员和至少200例正常对照染色体的序列进行筛查以识别普通多态性。用Blast研究分析比较来自于病人和已发表的基因序列间的同源性。通过来自基因组DNA模板的PCR和PCR产物测序重复确认变异体。发现变异体后进行变异片段克隆通过DNA测序确认,再进行功能检测。2.血样来自124例日本LVNC病人（TAZ基因筛查）,包括50例家族病例（男26例,女24例）和74例散发病例（男49例,女25例）,研究方法同前。结果1.在这个77例病例群体中发现7个YWHAE基因变异体,其中4个位于启动子,一个在内含子,一个是在外显子6的同义突变,最后一个在3’端的非翻译区。在对照样本中检测到其中的5个变异体,在统计学频率上与病例人群无显著性差异。2.在对照群体中,有2个变异体没有检测到（-458G>T和c.64+9G>A）,前者位于一个启动子,有2名患者检测到这个启动子变异体,而且这2名患者都做了LVNC其他候选基因的筛查,包括TAZ,DTNA,LDB3,FKBP12,STN,CSX/Nkx2.5和SCN5A,但是没有发现变异体。3.为了检测-458G>T变异体对启动子活性的作用,我们构建具有操纵萤火虫荧光素酶表达的启动子的结构（野生型和变异体）。在ECV-304细胞里这些结构的表达显示变异的启动子有大约50%的野生型启动子的活性。4.在先证者（III-2）和他的弟弟（III-3）TAZ基因的内含子1发现一个纯合子剪接区变异体（c.109+1 G>C）,他们的姐姐则是有这个变异体的杂合子（III-1）。其他家族成员未检测到这个变异体,包括父母和外祖父母及剩下的123例病人和200例正常对照样本。同时在124病人的群体中,发现另外2个变异体（IVS8-1G>C和158Ins C）,但都已经报道过。结论1.在这个77例的病例群体中,发现YWHAE基因7个变异体,通过多重silico分析没有任何一个变异体被预测改变RNA剪接或者外显子剪接增强子（ESE）序列。2.变异体-458G>T在对照群体中没有检测到,该变异体位于启动子区域,是一个调节C/EBP的效应元件,3.变异体-458G>T导致启动子活性的有效降低,资料表明这个变异体促进异常心肌形态发生,YWHAE是这个疾病的一个新的候选基因,尤其在被认为是其他无法解释的发育延迟,面部和视觉异常的病人。4.在TAZ基因筛查中,我们在一个家族的3个同胞中确定了一个剪接区变异体（c.109+1 G>C）,用软件能够预测到这个变异体导致剪接位点缺失。由于孩子的TAZ频发遗传,我们推断这是母亲携带性腺镶嵌遗传的证据,该例是目前在Barth综合症与LVNC的首例报道。
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