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目的体外培养SD大鼠乳鼠心肌细胞,用携带β3-AR受体基因的慢病毒转染心肌细胞,在此基础上用去甲肾上腺素(NE)诱导心肌细胞,建立心肌肥厚模型:(1)观察使用携带β3-AR基因的慢病毒转染心肌细胞是否可以有效提高心肌细胞β3-AR的表达;(2)观察β3-AR对心肌肥厚的影响;(3)探讨β3-AR是否通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径影响心肌肥大,为心肌细胞的实验研究提供更多参考方法,为β3-AR对心肌肥厚的影响的研究提供更多理论基础。方法体外培养SD大鼠乳鼠心室肌细胞,细胞培养24h后,分别以转染复数(multiplicity of infection,MOI)20、50、80、100转染只携带绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的慢病毒(空病毒),慢病毒转染心肌细胞72h后,在倒置荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白GFP表达情况,以确定慢病毒转染心肌细胞的最佳转染复数。心肌细胞以最佳MOI值转染携带β3-AR基因慢病毒24h后,用去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)诱导心肌细胞48h,建立体外心肌肥厚模型。实验分4组:(1)空白对照组(Control组):不转基因,常规培养细胞;(2)心肌肥厚组(NE组):不转基因,常规培养细胞+NE(2μmol/L)处理细胞48h;(3)β3-AR基因转染+NE组(β3-AR组):以携带β3-AR基因的慢病毒转染心肌细胞+NE(2μmol/L)处理细胞48h;(4)空病毒转染+NE组(空病毒组):用只携带GFP基因的慢病毒(空病毒)转染心肌细胞+NE(2μmol/L)处理细胞48h。用免疫荧光法鉴定心肌细胞,倒置荧光显微镜观察病毒转染组绿色荧光蛋白(GFP)表达,免疫印迹法(Western Blot)和q RT-PCR方法检测β3-AR、丝裂原活化蛋白激酶p38(p38MAPK)、细胞外信号调控激酶(ERK1/2)及原癌基因c-myc、c-fos蛋白水平和RNA水平的表达。结果(1)原代心肌细胞鉴定:免疫荧光法鉴定心肌细胞,分离培养的心肌细胞纯度可达95%以上;(2)慢病毒转染效果的检测:以不同MOI的慢病毒转染心肌细胞,在倒置荧光显微镜下观察,计算荧光阳性细胞百分比,发现MOI=50时病毒转染率最高。Western Blot检测各组细胞中β3-AR蛋白表达水平,与NE组和空病毒转染组相比,病毒转染组β3-AR表达增加(P<0.05),结果说明构建的β3-AR慢病毒可以有效提高原代心肌细胞中β3-AR的表达;(3)过表达β3-AR对心肌肥厚的影响:病毒转染24h后,用NE诱导细胞48h,用Western Blot和q RT-PCR方法检测原癌基因c-myc、c-fos表达变化。与空白对照组相比,NE组、β3-AR组、空病毒组c-myc、c-fos蛋白水平和RNA水平的表达均上调(P<0.05),其中β3-AR组明显高于NE组(P<0.05),说明随β3-AR表达增加,心肌肥厚加重;(4)β3-AR表达增高影响MAPK通路的激活:Western Blot检测各组细胞p38MAPK和ERK1/2磷酸化水平,q RT-PCR检测各组细胞中p38MAPK和ERK的m RNA表达,结果显示NE组、β3-AR组、空病毒组的p38MAPK、MEK/ERK蛋白磷酸化水平和RNA表达明显高于对照组(P<0.05),其中β3-AR转染组p38MAPK、MEK、ERK1/2表达高于NE组(P<0.05),说明β3-AR表达增加可激活MAPK通路,促进心肌肥厚的病理过程,β3-AR表达影响了MAPK通路激活。结论(1)携带β3-AR基因的慢病毒转染心肌细胞可使心肌细胞有效高表达β3-AR;(2)在体外β3-AR过表达可促进NE诱导的心肌肥厚;(3)在体外β3-AR过表达可能通过激活MAPK通路介导心肌肥厚。