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研究背景:原发性开角型青光眼（primary open-angle glaucoma,POAG）是一种常见的致盲性眼病。病理性眼压升高是POAG最主要的危险因素。小梁网是房水排出眼睛的主要途径,其功能障碍会使房水流出阻力增加,进而导致眼压升高。有研究表明氧化应激参与POAG小梁网病理损伤,促进小梁网细胞凋亡,增加细胞外基质的异常合成。因此,探究小梁网氧化应激损伤的分子机制,寻求有效的抗氧化靶点对POAG的预防和治疗至关重要。电压门控氯离子通道（voltage-gated chloride channel,CLC）在哺乳动物中广泛表达。其中CLC3与液体和离子的跨上皮转运密切相关,在细胞体积调节、细胞增殖、凋亡、吞噬等多种生理病理过程中发挥重要作用。我们的前期研究表明,CLC3在细胞吞噬、细胞增殖等方面影响小梁网的转运功能。接下来我们将探究CLC3在小梁网细胞氧化应激损伤中的作用和机制。H2O2是一种经典的氧化应激诱导剂,常用于探究细胞氧化应激的相关研究中。但是H2O2诱导的氧化应激反应急剧,与体内生理条件存在差异。我们致力寻找一种氧化应激诱导因子,构建更接近于生理状态的氧化应激模型。血管紧张素II（angiotensin II,Ang II）是一种体内存在的应激诱导因子,在情绪紧张、寒冷刺激等情况下可通过激活NADPH氧化酶,诱导细胞氧化应激反应。肾素-血管紧张素系统在小梁网广泛表达,并在POAG患者房水中显著升高。因此,我们利用H2O2和Ang II在体外构建了两种人小梁网细胞氧化应激模型,探究CLC3在两种氧化应激模型中的作用和机制,以期为青光眼的治疗寻求新靶点。研究目的:探究CLC3在H2O2和Ang II诱导的人小梁网原代细胞（human trabecular meshwork cells,HTMCs）氧化应激损伤中的作用及机制。研究方法:1、收集POAG患者小梁网组织并检测CLC3蛋白表达情况通过吉林大学相关机构的伦理审批后,我们收集POAG患者手术中拟丢弃的小梁网组织,进行冰冻切片和免疫荧光染色检测CLC3的表达情况。2、建立H2O2诱导的HTMCs氧化应激模型,通过CCK-8、免疫荧光、Western Blot等实验方法检测CLC3蛋白表达情况、细胞活力、细胞形态、细胞内氧化应激水平和细胞凋亡情况。分别使用氧化应激抑制剂NAC、CLC3过表达慢病毒和CLC3si RNA对HTMCs氧化应激模型进行干预,检测细胞活力、细胞氧化应激水平和细胞凋亡的变化情况。探究CLC3过表达慢病毒和CLC3 si RNA干预后对抗氧化信号通路Nrf2/HO-1激活的影响。利用CLC3过表达慢病毒及Nrf2 si RNA共同处理HTMCs,以明确CLC3调控细胞氧化应激和凋亡的信号通路。3、建立Ang II诱导的HTMCs氧化应激模型,通过CCK-8、q PCR、免疫荧光、Western Blot等实验方法检测CLC3蛋白表达情况、细胞活力、细胞内氧化应激水平和细胞外基质表达情况。分别使用氧化应激抑制剂NAC、CLC3过表达慢病毒对HTMCs氧化应激模型进行干预,检测细胞氧化应激水平和细胞外基质的变化情况。探究CLC3过表达慢病毒干预后对抗氧化信号通路Nrf2/HO-1激活的影响。研究结果:1、对收集的3例POAG患者小梁网组织进行冰冻切片和免疫荧光染色,结果显示CLC3在POAG患者小梁网组织中呈阳性表达。2、成功构建了H2O2诱导的HTMCs氧化应激模型,200μM的H2O2作用24小时,细胞活力显著降低,细胞内ROS含量和MDA含量显著升高,线粒体膜电位下降。Western Blot结果显示Bcl-2/BAX比值降低,caspase3活性裂解片段增多。5m M的NAC预处理显著增强HTMCs活力,显著降低H2O2引起的氧化应激和线粒体途径凋亡。这些结果表明H2O2通过氧化应激反应引起HTMCs线粒体途径凋亡。H2O2促进HTMCs细胞内CLC3蛋白表达,表明CLC3参与H2O2诱导的氧化应激。q PCR和Western Blot检测结果证明成功构建了CLC3过表达和基因敲除低表达的HTMCs。CLC3基因敲除低表达可以抑制Nrf2/HO-1蛋白表达,促进HTMCs氧化应激和线粒体途径凋亡。CLC3过表达可以促进Nrf2核转移,促进Nrf2/HO-1蛋白表达,抑制HTMCs氧化应激和线粒体途径凋亡。Nrf2基因敲除低表达可以抑制CLC3过表达引起的抗氧化、抗凋亡功能。3、成功构建了Ang II诱导的HTMCs氧化应激模型,1μM的Ang II作用24小时,细胞内ROS含量增加,NOX1、NOX2 m RNA水平增加。Ang II可以促进Fibronectin、Collagen1蛋白表达。NAC和Irbesartan可以阻断Ang II诱导的氧化应激和细胞外基质的表达。Ang II还可以促进CLC3蛋白表达。CLC3过表达可抑制Ang II诱导的氧化应激和细胞外基质沉积,并能促进Nrf2核转移,促进HO-1蛋白表达。结论:1、CLC3在POAG患者小梁网组织中呈阳性表达。2、成功构建了H2O2诱导的HTMCs氧化应激模型。H2O2可通过氧化应激反应诱导HTMCs发生线粒体途径凋亡。另外,H2O2可增加HTMCs中CLC3的表达,并且CLC3可通过促进Nrf2/HO-1信号通路抑制H2O2诱导的HTMCs氧化应激损伤和线粒体途径凋亡。3、成功构建了Ang II诱导的HTMCs氧化应激模型。Ang II可通过氧化应激反应促进HTMCs的细胞外基质沉积,提示Ang II在POAG的发生发展中可能发挥重要作用。另外,CLC3也可通过促进Nrf2/HO-1信号通路抑制Ang II诱导的HTMCs氧化应激损伤和细胞外基质沉积。4、氯离子通道CLC3在H2O2和Ang II诱导的小梁网氧化应激中均具有保护作用,CLC3可能成为POAG治疗的新靶点。