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目的：清开灵注射液发生严重不良反应时,常用抗过敏药物异丙嗪来进行治疗。已有临床前及临床数据研究证明,清开灵能导致潜在的心律失常,本研究对抗过敏药物异丙嗪用于抢救清开灵注射液引起的严重不良反应患者的方案提出了质疑,通过临床前的心脏安全性评价实验,来验证异丙嗪可加重清开灵注射液所致的缓慢性心律失常作用。药品：1.清开灵：清开灵注射液（QKL）,批号：11040664,国药准字Z13020880,河北神威药业有限公司生产。2.异丙嗪：异丙嗪盐酸盐（Promethazine, PMZ）,批号：1001154582,是从Sigma-aldrich公司购买。方法：1.豚鼠在体心电图记录：20%乌拉坦（5mL/kg）对豚鼠进行腹腔注射麻醉,以仰卧位进行固定,分离出一侧颈静脉,进行插管,再给药。四肢皮下扎入针形电极引导记录Ⅱ导联心电信号,经四道生理记录仪采样并存入计算机。于静脉推注药物5min后记录心电图,分析心率、P-R间期、QRS间期和QTc间期。按照清开灵注射液说明书所规定的：成人用量为每次40ml,在体实验采用40ml为1倍临床剂量。按国际标准豚鼠用剂量为人用剂量的4.6倍,换算为豚鼠在体1倍剂量为3.1ml/kg。按照注射用异丙嗪盐酸盐说明书所规定的：抗过敏用量每次25mg,最高量不得超过每次100mg,在体实验中采用临床最高用量100mg/60kg为1倍临床剂量。同样按国际标准换算为豚鼠在体1/2倍剂量为3.83mg/kg,1倍剂量为7.67mg/kg,2倍剂量为15.33mg/kg,5倍剂量为38.35mg/kg。2.豚鼠离体心电图记录：采用改进的Langendoff灌流系统,经主动脉进行离体心脏灌流,心脏复跳后在心外膜下置3根银丝电极：正极置于心尖处,负极置于右心房,接地电极置于主动脉根部,引导出离体心脏心电图。待豚鼠心脏跳动稳定后,信号经四道生理记录仪输入计算机记录,分析心率、P-R间期、QRS间期和QTc间期。清开灵注射液的说明书规定成人用量为40m1。按成人体重60kg为例计算；成人细胞外液约为12000ml（按体重的20%算）,因此换算成临床血药浓度即为3.3ml/L。据上述方法换算后,离体实验的组织和细胞灌流液1倍临床浓度为3.3ml/L,10倍临床浓度为33ml/L。根据之前的预实验可得知,单独异丙嗪实验,采用的浓度为0.1、1、10和50μmol/L,与清开灵合用时采用1、10、30和50μmol/L。3.豚鼠乳头肌动作电位记录：用20%乌拉坦（5mL/kg）对豚鼠进行腹腔注射麻醉后,快速开胸取出心脏,置于0-4℃无钙灌流液中使之停搏,修剪,取出左心室乳头肌1条,将其固定于恒温浴槽底部。充以95%02+5%CO2饱和的含钙台氏灌流液,在恒温（36±0.5℃）下以5ml/min的速度恒速灌流,标本在浴槽内稳定1小时后进行实验。给予强度为1.5倍阈值,波宽10ms,刺激频率1Hz的方波刺激。信号经四道生理记录仪输入计算机记录。4.大鼠左心室肌细胞L型钙电流记录：采用改良的酶解法分离获取大鼠单个心室肌细胞。采用膜片钳全细胞记录方法,在室温（20-22℃）下进行。将细胞悬液数滴加入倒置显微镜上的灌流槽中（RC-26,Recording Chamber150μL, USA）,细胞贴壁后,用电流记录外液灌流。选取边缘无卷曲,横纹清晰,表面无颗粒,无收缩的细胞进行封接实验。玻璃毛细管（Sutter instrument O.D.1.5mm, I.D.1.1mm with filament）经微电极拉制仪制成尖端直径约为1μm的电极,电极充灌电流记录内液后,入水阻抗约为5MΩ。调节三维操纵器使电极尖端移向细胞表面进行封接,阻抗达到1GΩ以上后补偿快电容,并给予负压破膜形成全细胞记录模式,调节慢电容补偿和串联电阻补偿,以减少瞬时充放电电流和钳制电位误差。钳制电压为-80mV,阶跃到-40mV并维持200ms（使Na+电流失活）,然后施加到0mV、300ms的试验电压。在电压钳制模式下,记录用药前后L型钙通道的变化。无钙灌流液mmol/L):NaCl117, KCl5.7, NaHCO34.4, NaH2PO41.5, MgCl21.7, HEPES20, Glucose20, Taurine10, pH用NaOH调至7.4。KB液组成为为;mmol/L):L-glutamic acid50, KCl40, KH2PO420, Taurine20, MgCl2-6H2O3, KOH70, EGTA0.5, HEPES10, Glucose10. pH用NaOH调至7.4。电极记录外液组成为I;mmol/L):NaCl132, CsCl5.4, CaCl21.8, MgCl2-6H2O1.8, NaH2PO·2H2O0.6,4AP5, HEPES10, glucose-H2O10, Na-pyruvate5. pH用NaOH调至7.4。电极记录内液组成为（mmol/L）:CsCl130, MgCl2·6H2O2, EGTA11, HEPES20, glucose-H2O10, Na2ATP2, GTP0.1.pH用NaOH调至7.4。5.全细胞电压钳记录hNav1.5电流：合成的hNav1.5cDNA（NM000335.4）被克隆到带有G418耐药性表达载体pcDNA3.1。构成的质粒在脂质体2000转染试剂作用下,转染至HEK （human embryo kidney）细胞系中。在Dulbecco’s改进的Eagle培养基上培养（10%小牛血清和250μg/mlG418） hNav1.5细胞株,通过规范的次代培养以维持最适宜的状态用于hNav1.5电流记录。采用膜片钳全细胞记录方法,在室温（20-22℃）下进行。钳制电压为-80mV,阶跃到-20mV维持20ms。电流信号经膜片钳放大器放大并经数字-信号转换器与计算机对话,信号的发放和采集均由pClamp10.0软件完成。记录外部溶液（mmol/L）:NaCl25、TEAC1122、MgC121、Glucose10、HEPES10、 CaC121.8, pH用NaOH调至7.4,渗透压值用sucrose调至290mOsm。记录内部溶液（mmol/L）:CsF129、MgC122、EGTA11、HEPES10、Na2ATP3、pH用CsOH调至7.2,渗透压值用sucrose调至290mOsm。6.全细胞电压钳记录hERG电流：合成的hERG cDNA （NM000238.2）被克隆到带有G418耐药性表达载体pcDNA3.1。构成的质粒在脂质体2000转染试剂作用下,转染HEK （human embryo kidney）细胞系中。在Dulbecco’s改进的Eagle培养基上培养（10%小牛血清和250μg/ml G418）hERG细胞株,通过规范的次代培养以维持最适宜的状态用于hERG电流记录。采用膜片钳全细胞记录方法,在室温（20-22℃）下进行。钳制电压为-80mV,阶跃到-50mV维持50ms,然后施加到50mV4800ms试验电压,最后施加到-50mV5000ms试验电压。电流信号经膜片钳放大器放大并经数字-信号转换器与计算机对话,信号输入经过1kHz的滤波,信号的发放和采集均由pClamp10.0软件完成。结果：1.异丙嗪及合用清开灵注射液对豚鼠在体心电图的影响：清开灵注射液在3.1ml/kg和15.5ml/kg时,对豚鼠在体心电图的P-R、QRS、QTc间期及心率（P>0.05）未能有显著改变；在清开灵注射剂31ml/kg和93ml/kg时,呈剂量依赖性的延长豚鼠的QRS间期及QTc间期,而且清开灵注射液93ml/kg时还能显著性地延长P-R间期（P<0.05）。对于异丙嗪而言,3.83mg/kg（1/2临床剂量）和7.67mg/kg（1倍临床剂量）没有明显改变豚鼠在体心电图的心率、P-R、QRS以及QTc间期（P>0.05）；异丙嗪15.33mg/kg（2倍临床剂量）显著的延长了QRS间期；异丙嗪38.35mg/kg（5倍临床剂量）,显著减慢心率以及延长P-R、QRS以及QTc间期。清开灵注射剂31ml/kg时能显著延长豚鼠心电图的QRS间期以及QTc间期,当清开灵注射剂31ml/kg合用异丙嗪38.35mg/kg剂量时,能进一步延长清开灵注射液以及清开灵注射液合用7.67ml/kg作用下的P-R、QRS以及QTc间期,而且对豚鼠心率有显著性减慢的作用（P<0.05）。2.异丙嗪及合用清开灵注射液对豚鼠离体心电图的影响：33ml/L的清开灵注射液显著地延长QRS间期（P<0.05）；清开灵注射剂在66和99ml/L时显著减慢心率并显著延长P-R, QRS间期（P<0.05）,而且在99ml/L时还能显著延长其QTc间期（P<0.05）。对于异丙嗪而言,浓度为10μmol/L时明显减慢离体豚鼠心脏心率（P<0.05）及延长QRS间期；50μmol/L的异丙嗪能明显减慢豚鼠心脏心率而且显著延长QRS间期和QTc间期（P<0.05）。当选用33ml/L清开灵注射液作为基础浓度,再合用1、10、30、50μmol/L的异丙嗪,心率出现不同程度浓度依赖性减慢,还进一步延长了清开灵作用下的P-R间期、QTc以及QRS间期（P<0.05）。再用清开灵33ml/L进行洗脱后,各参数会出现部分恢复。3.异丙嗪及合用清开灵注射液对豚鼠乳头肌动作电位的影响：单独灌流99μl/ml的清开灵注射液,豚鼠的左心室乳头肌的动作电位未见消失,而浓度达到165μl/ml时动作电位部分消失。对于异丙嗪而言,浓度为26μmol/L时,未出现动作电位消失。而当清开灵注射液99μl/ml合并异丙嗪10μmol/L时,动作电位就能出现部分的消失。同时再进行灌流液洗脱后,发现动作电位又可以恢复到正常。这就表明异丙嗪和清开灵注射液合用时,是加重了清开灵注射液抑制动作电位的形成。4.异丙嗪及合用清开灵注射液对大鼠左心室肌细胞L型钙电流的影响：清开灵注射液呈剂量依赖性的阻滞大鼠心室肌细胞L型钙电流,抑制其L型钙电流50%浓度（IC50）为52.2±10.9ml/L。异丙嗪对大鼠心室肌细胞的L型钙电流也有抑制作用,抑制其的50%浓度（IC50）是9.2±1.3μmol/L。异丙嗪在清开灵3.3ml/L存在的条件下,抑制大鼠L型钙电流50%浓度（IC50）为7.0±1.0μmol/L,两组之间存在显著性差异。5.异丙嗪及合用清开灵注射液对hNav1.5电流的影响：异丙嗪浓度依赖性地抑制了]hNavl.5电流,其IC5o为6.4±1.4μmol/L。异丙嗪在清开灵3.3ml/L存在条件下,抑制hNavl.5电流50%浓度（IC5o）为4.0±0.4μmol/L,两组之间存在显著性差异。6.异丙嗪及合用清开灵注射液对hERG电流的影响：异丙嗪可计量依赖性的阻滞hERG电流,抑制hERG电流50%的浓度（IC50）为1.6±0.2μmol/L。异丙嗪在清开灵3.3ml/L存在的条件下,其抑制hERG电流50%浓度（IC5o）为1.0±0.2μmol/L,两组之间存在显著性差异。结论：1.豚鼠心脏的在体和离体实验能确证清开灵注射液能稳定的诱发缓慢性心律失常。2.在豚鼠心脏的在体实验中,异丙嗪有减慢其心律失常的作用。在离体乳头肌的实验中可以使动作电位部分消失。同时对大鼠心室肌细胞L型钙电流、hNav1.5以及hERG电流都呈浓度依赖性的抑制,其IC50分别为9.2±1.3μmol/L、6.4±1.4μmol/L、1.6±0.2μmol/L.3.异丙嗪与清开灵注射液的合用并没有起到救治作用,反而加重了清开灵注射液减慢心率以及显著延长P-R间期以及QRS间期和QTc间期的作用,进一步加重清开灵致缓慢性心律失常的作用。4.异丙嗪在清开灵3.3ml/L的存在条件下,对大鼠心室肌细胞L型钙电流、hNavl.5以及hERG电流都呈浓度依赖性的抑制,IC50分别为7.0±1.0μmol/L、4.0±0.4μmol/L、1.0±0.2μmol/L。通过比较可知二者合用增强了对hNav1.5和L型钙电流的抑制作用,也就是异丙嗪加重清开灵致心律失常的作用机制之一。在清开灵和异丙嗪合用时,hERG电流也出现了抑制,但在豚鼠动作电位的实验中没有表现出明显的延长作用,这可能是它们同时抑制了L型钙电流以及hERG电流的一个综合表现。