前言脑是人体的生命中枢,是最易受损的器官。脑损伤在法医鉴定工作中很常见,且随着经济和交通的迅速发展,创伤性颅脑损伤的发生率逐年升高,已经严重威胁人们的生命健康。因此关于脑损伤时间、机制、损伤程度的研究就显得非常重要。Homer蛋白是突触后密度蛋白家族成员之一,它是联系突触内细胞骨架蛋白、信号蛋白的重要物质。最初在神经系统被发现,它在信号转导、突触形成、受体转运和受体细胞内定位起重要作用。癫痫、高频刺激、损伤及发育等兴奋性突触活动可诱导Homer蛋白表达增加。目前为止,颅脑损伤机制方面的研究很多,其中机制之一是通过代谢性谷氨酸受体(mGluRs)引起细胞内钙离子释放导致神经元损伤；有研究发现,Homer蛋白在代谢性谷氨酸受体引起的神经元损伤中起到重要作用；另有研究发现,在弥漫性颅脑损伤动物模型中Homer蛋白表达增加,因此有必要利用脑损伤模型,进一步观察Homer蛋白表达变化规律,完善Homer蛋白在各种脑损伤模型中的研究,为脑损伤时间推断法医鉴定提供参考依据。材料与方法一、动物模型的制作,分组与对照雄性Wistar大鼠50只,体重220-250g,由中国医科大学实验动物部提供。随机分为10组,其中包括8个实验组,1个正常对照组,1个假手术组,每组5只大鼠。实验组采用吴旭等研制的大鼠脑挫伤模型制作方法,制造大鼠局灶性闭合性脑挫伤模型。乙醚吸入预麻醉,大鼠称重后,2%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉。正中切开大鼠顶部头皮,在人字缝前3mm,矢状缝旁3mm处钻直径为5mm的圆形骨窗,保持硬脑膜完好,采用自由落体打击装置,以30g重锤从25cm高处落下,打击暴露的脑组织；假手术组以相同的方法钻孔,但不进行打击。术后动物分笼饲养,保持垫料清洁及空气通畅。于伤后0.5、3、6、12h和1、3、5、7d将大鼠乙醚麻醉后脱颈椎处死。手术取出脑组织,沿冠状方向将挫伤区平均分为两部分,并对损伤周边区进行取材、修块,一份用于免疫组化染色,另一份用于Western blot检测。对照组和假手术组以同样方法取相同部位的脑组织作为对照。二、免疫组织化学染色脑组织经4%多聚甲醛固定后,水洗,梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,制作5μm厚度切片。采用链霉素-生物素法(SP法)进行免疫组化染色,并用苏木素复染细胞核,具体步骤同试剂盒说明书。Homer单克隆一抗(1：200)稀释,4℃孵育过夜。染色过程中另以一抗稀释液替代一抗,作为阴性对照。小鼠来源Homer(D-3)单克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology,小鼠SP免疫组织化学试剂盒(SP-9002)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。三、Western blot检测对用于Western blot的脑组织进行裂解、匀浆、离心,提取蛋白并进行蛋白定量,聚丙烯酰胺凝胶电泳,半干法转印,5%脱脂牛奶封闭,一抗(1：800稀释)、二抗(1：5000稀释)孵育后,DAB显色。实验中以GADPH为内参。实验结果一、免疫组织化学染色结果对照组及假手术组神经元胞浆中可见少量Homer蛋白表达,阳性染色较淡。实验组中,脑挫伤后0.5h、3h组挫伤周边区可见阳性细胞数逐渐增多,胞浆内Homer蛋白表达增多,阳性染色较深；6h、12h、1d组阳性细胞数维持在较高水平,伤后12h组阳性细胞数达到高峰,随后3d组可见阳性细胞数明显下降,5d、7d组基本降至基础水平,并可见阳性细胞染色较淡。二、Western blot结果对照组及假手术组可见少量Homer蛋白表达；脑挫伤后0.5h、3h组可见Homer蛋白表达增加,6h、12h、1d组Homer蛋白表达维持较高水平。12h组达到高峰,随后3d组下降,5d、7d组降至基础水平。取损伤后不同时间段条带的平均光密度值,经统计分析,差异有统计学意义(P<0.05)。结论本实验在建立大鼠局灶性闭合性脑挫伤模型的基础上,应用免疫组织化学染色、Western blot方法检测大鼠脑挫伤后Homer蛋白表达。结果表明：1、正常大鼠脑组织中有少量Homer蛋白的表达。2、Homer蛋白在脑挫伤后挫伤周边区随时间延长表达增多,伤后12h达到高峰,随后表达逐渐减少,5d、7d恢复至基础水平,呈单峰变化。3、大鼠局灶性脑挫伤后Homer蛋白表达呈时间相关性变化。