生物碱以其良好的药用活性及丰富的化学结构一直是天然产物领域的研究热点。本课题的研究对象三环咔唑生物碱Neocarazostatin A,对由自由基引起的脑组织过氧化症状有强烈抑制作用,具备自由基清除药物的开发潜力。有关Neocarazostatin A中咔挫“A”环及其侧链的生物合成机制一直悬而未决,前期研究表明,该部分结构单元的组装可能由NzsH、NzsI、NzsJ、NzsE和NzsF等五个酶共同参与完成。本论文通过蛋白表达以及体外测活等手段,依次阐明了乙酰乳酸合酶NzsH、酰基载体蛋白NzsE、以及β-酮酰基-酰基载体蛋白合成酶(KAS Ⅲ)NzsF在“A”环组装中的作用机制。实验结果表明,NzsH可催化咔唑前体吲哚丙酮酸与延伸单元丙酮酸之间的酮醇缩合反应,从而完成“A”环骨架组装的第一步,该酶活性同时也依赖于辅因子焦磷酸硫胺素(ThDP)。另一方面,“A”环C4侧链的前体是由NzsF催化乙酰CoA与丙二酰-NzsE之间的克莱森缩合反应而成,再经来自于宿主初级代谢中参与脂肪酸合成的β-酮酰基还原酶MA37-FabG还原该四碳单位的C3位酮基,最后掺入到“A”环的组装中。总之,本研究成功于体外重构了 Neocarazostatin A咔唑“A”环生物合成的部分途径,既丰富了我们对ThDP依赖的酶家族的认识,又加深了我们对链霉菌初级代谢和次级代谢之间交叉对话的理解,为后续完全揭示三环咔唑“A”环和家族成员不同碳长侧链的组装机制以及对其进行结构改造制备更多结构类似物打下了坚实的基础。