【摘 要】
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背景及目的全球癌症统计数据指出2018年全球范围内结直肠癌（colorectal cancer,CRC）的发病率在最常见的恶性肿瘤中为第三位,致死率居于第二位[1]。在我国结肠癌发病率居于恶性肿瘤发病率前五位[2],多数患者确诊时已处于晚期,手术切除病灶的治疗效果不佳,治疗过程中容易出现化疗抵抗。因此进一步探讨结直肠癌发病机制,寻找新的分子靶点,推进个体化治疗手段是科研工作者的重要研究方向。mic
【基金项目】
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国家卫生计生委公益事业专项（No.201502026）； 广东省科技计划项目（No.2017B020209003）； 国家自然科学基金（No.81772964）；
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背景及目的全球癌症统计数据指出2018年全球范围内结直肠癌（colorectal cancer,CRC）的发病率在最常见的恶性肿瘤中为第三位,致死率居于第二位[1]。在我国结肠癌发病率居于恶性肿瘤发病率前五位[2],多数患者确诊时已处于晚期,手术切除病灶的治疗效果不佳,治疗过程中容易出现化疗抵抗。因此进一步探讨结直肠癌发病机制,寻找新的分子靶点,推进个体化治疗手段是科研工作者的重要研究方向。microRNA是一类非编码的小分子单链RNA,一般有18-25个碱基。最常见的作用方式是与靶基因的3’-UTR结合,抑制靶基因的表达,从而发挥功能。microRNA已经被证明在多种恶性肿瘤中有重要的作用[3],在结直肠癌中可以调控肿瘤细胞的生物学行为[4],并且与结直肠肿瘤干细胞密切相关[5],是基础研究的重点领域之一。本研究发现了 miR-532-3p是一个在结直肠癌组织中低表达的microRNA分子,具有抑制结直肠癌细胞化疗抵抗、增殖及迁移的等恶性生物学行为的作用,并对其可能的作用机制进行探讨。研究方法1.miR-532-3p在结直肠组织及细胞系中的表达验证1)对GSE41655芯片数据分析明确miR-532-3p在结肠腺瘤及肿瘤组织中的表达情况;2)qRT-PCR实验检测miR-532-3p在结直肠肿瘤组织及配对正常组织、结直肠癌细胞系及正常肠上皮细胞系中的表达水平。2.miR-532-3p抑制结直肠癌细胞恶性生物学行为1)miR-532-3p过表达细胞的基因芯片分析,筛选变化差异较大的细胞功能相关的信号通路;2)细胞凋亡:通过细胞凋亡实验验证miR-532-3p对结直肠癌细胞凋亡以及化疗抵抗的影响;3)体外增殖:将miR-532-3p mimics和inhibitors瞬时转染至结直肠癌细胞中,验证效率后进行细胞周期实验及CCK8实验;4)体内增殖:miR-532-3p过表达及干扰慢病毒感染结直肠癌细胞进行裸鼠皮下成瘤实验并取瘤体行Ki-67的免疫组化染色;5)体外迁移:瞬时转染miR-532-3p mimics和inhibitors,通过划痕愈合实验及transwell小室迁移实验进行验证。3.miR-532-3p靶向ETS1/TGM2轴调控wnt/β-catenin信号通路机制验证1)miR-532-3p过表达基因芯片中表达下调基因与预测靶基因数据库交集明确靶基因,并通过qRT-PCR、western Blot、裸鼠皮下成瘤实验的瘤体组织IHC、双荧光素酶报告基因实验进行验证;2)通过western blot实验明确miR-532-3p对Wnt/β-catenin信号通路的作用;3)通过CCK8、划痕及凋亡实验验证ETS1、TGM2在结直肠癌中的功能;通过ChIP实验验证ETS1对TGM2的转录调控作用;4.ETS1/TGM2轴参与miR-532-3p调控结直肠癌发生发展的过程通过恢复实验（CCK8、细胞周期、细胞凋亡、划痕及transwell实验）验证ETS1/TGM2轴参与miR-532-3p调控结直肠癌的过程。研究结果1.与正常组织比较,结直肠腺瘤及肿瘤组织中miR-532-3p的表达水平明显降低;并且在恶性程度较高的肿瘤细胞系LOVO及HT29细胞中表达较低,在恶性程度较低的细胞系SW480、RKO中表达水平较高,且FHC中表达水平最高。2.miR-532-3p过表达基因芯片提示p53信号通路明显激活,western blot也验证了这一结论。miR-532-3p过表达的细胞凋亡率上升,5-氟尿嘧啶及顺铂处理细胞后趋势与之相同,提示miR-532-3p可以促进凋亡并且抑制结直肠肿瘤细胞对5-氟尿嘧啶及顺铂的化疗抵抗作用。3.miR-532-3p过表达后结直肠癌细胞G1/M期转化阻滞,细胞周期相关蛋白也可佐证此结论,体外及体内增殖减缓;迁移行为受到抑制,EMT标志蛋白表达水平下调。4.miR-532-3p直接靶向ETS1、TGM2,参与Wnt/β-catenin信号通路,同时ETS1可作为TGM2的转录因子直接调控TGM2表达水平;二者具有共同促进结直肠癌进展的能力。5.恢复性实验证明,ETS1、TGM2过表达可抵消miR-532-3p对结直肠癌恶性生物学行为的抑制作用。结论本研究首次证实miR-532-3p在结直肠腺瘤及结直肠肿瘤中低表达,过表达miR-532-3p可通过靶向ETS1/TGM2轴来抑制Wnt/β-catenin信号通路的异常激活,从而抑制结直肠癌细胞的化疗抵抗、增殖及迁移的恶性生物学行为。
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