论文部分内容阅读
突变体是克隆和研究基因功能的良好材料,但有关利用大豆突变体分离基因的研究相对较少。光合作用与农作物产量密切相关,叶片黄化引起光合效率和产量降低。利用叶色突变体分离大豆叶色调控基因,深入解析其调控的遗传规律和分子机制,可以为作物育种提供标记基因,为高光效育种提供参考。本研究利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变处理山东省高产优质品种“菏豆12号”(Hedou 12)及Williams 82,获得一批可遗传的突变体。对其中的一个叶黄化突变体gmyld1(Glycine max yellow leaf chlorophyll deficient 1)进行了突变基因定位及克隆研究,结果如下:通过EMS诱变,筛选出可遗传的M2/3代大豆64个与产量性状相关的突变体:28个叶形及叶色,8个育性,28个籽粒大小、种脐和种皮颜色相关。对其中的9个突变体与Williams 82进行杂交,获得了可用于基因定位的杂交F2代群体。gmyld1表型分析发现,其幼叶黄化,叶绿素含量比对照降低88.41%,光合效率下降。叶绿素合成途径中间产物含量分析发现,与对照相比,gmyld1中Mg-Proto(镁原卟啉)、pchlide(原叶绿素酸酯)和chlide(叶绿素酸酯)含量显著降低,Urogen(尿卟啉原)含量显著升高,推测gmyld1叶绿素合成受阻于Urogen到Mg-Proto的阶段。该途径中编码尿卟啉原III脱羧酶的相关基因(Glyma.11G235400、Glyma.18G021500、Glyma.13G269900和Glyma.12G229700)和编码 Mg-螯合酶的相关基因(Glyma.11G016000、Glyma.13G171800、Glyma.01G226700、Glyma.13G232500和Glyma.15G080200)表达水平显著降低。显微透射电镜观察发现Gmyld1幼叶类囊体堆叠紊乱、叶绿体发育异常,表明该基因突变引起了叶绿体发育及叶绿素合成受阻。遗传分析表明,gmyld1与Williams 82杂交F2代群体中出现了野生型和突变体的分离,且遗传分离比为3:1,表明gmyld1表型受单隐性核基因控制。利用菏豆12号全基因组重测序结果与Williams 82参考基因组序列对比,筛选出两品种间的610,515个SNP和120,518个Indel差异。通过PCR扩增筛选出84个Indel位点作为锚定分子标记,它们分布于11-20号染色体上,并对其构建了物理图谱。对gmyld1与荷豆12号回交F2代群体(BClF2)中分离的野生型和突变体材料进行BSA-seq分析,经Mutmap和SNP标记关联分析,获得与突变位点关联的候选区间Chr20:8,012,091...10,281,887,该区间长度为2.27 Mb,包含112个基因,3个候选SNP位点。用覆盖20条染色体的128个Indel锚定标记及gmyld1与Williams 82杂交F2代群体获得的32个黄化突变体进行粗定位,将突变位点初步定位在20号染色体的21.31Mb区间内,该区间包含BSA-seq定位的区间。通过进一步扩大群体,将突变基因定位在Chr20:8,438,195...8,822,768区间,该区间长度384.57 Kb,含有16个基因。进一步分析发现,在16个基因中,有一个基因的序列号与BSA数据分析发现的1个候选基因(Glyma.20G046200)相同,推测该基因可能是调控大豆叶片黄化的关键基因。进一步克隆并测序发现,在16个基因中,仅有Glyma.20G046200CDS的+1629碱基位点发生碱基G-A的替换,导致其编码氨基酸由苯丙氨酸变为丝氨酸,推测该位点突变是引起了大豆叶色黄化的原因,该基因为候选基因(命名为GmYLD1,Yellow Leafchlorophyll Deficient 1)。对gmyld1和荷豆12号的RNA-seq结果分析发现,与对照相比,在gmyld1中511个基因表达上调,265个基因表达下调。其中光合作用及叶绿素合成相关基因表达水平差异显著,PsbA(光系统Ⅱ相关基因)、PsbA(光系统I相关基因)、PetB(细胞色素b6/f复合物相关基因)及ATP合酶相关基因表达显著上调,而PsbK(光系统Ⅱ相关基因)、Lhca2、Lhcb1及Lhcb6(光捕获蛋白复合体相关基因)表达显著下调。基因表达模式分析发现,候选基因GmYLD1在大豆的根、茎、叶中均有表达,且表达量为根>叶>茎,为进一步研究该基因调控叶色黄化的分子机制奠定了基础。