非小细胞肺癌无论在男女肿瘤中都具有较高的发病率和极高死亡率。近些年来,男性肺癌患者的发病达到平台期,女性肺癌发病率却逐年上升。2014年全国肿瘤登记中心发布的数据显示:我国2010年女性新增肺癌发病病例为18.96万,居女性第2位恶性肿瘤,占女性新发恶性肿瘤的14.75%。女性肺癌出现年轻化、发病率高的不同特点。这类女性肺癌大多无抽烟史,而且腺癌更多。虽然女性肺癌患者的发病增多,部分研究归因于女性抽烟人群的增多、女性烹调油烟或被动抽烟、女性对烟雾的易感性、人乳头瘤病毒(HPV)感染或现代社会女性生活压力增大造成的影响。但部分文献研究却得不到此种结论。不容忽视的是烟雾对肺癌影响是以鳞癌发病为主要表现的。以腺癌为主的女性肺癌增多和年轻化是很难解释的。男女之间性别差异影响着非小细胞肺癌发生、疾病进展和分子生物学不同特性,并决定治疗效果和预后。男女之间最大区别为性激素不同。性激素中最主要激素是雌激素。雌激素(Estrogen)是一种甾体类固醇性激素,人体中的雌激素有三种:雌二醇、雌三醇和雌酮。其中雌二醇活性最强。女性雌激素主要由卵巢的卵泡分泌,少量由女性怀孕后的胎盘产生,和雌激素受体具有高度的亲和力。在绝经后女性中,卵巢不再产生雌激素素,血清雌二醇水平显著下降。研究表明雌激素在体内或体外试验中都可诱导肿瘤细胞的增殖,抗雌激素药物可以阻断这种作用。其次是孕激素,孕激素也是女性甾体激素,由卵巢黄体产生的孕激素是孕酮。促黄体生成素(LH)是垂体前叶嗜碱性细胞分泌的一种糖蛋白激素,主要是促进卵巢排卵,在FSH的协同作用下,形成黄体并分泌孕激素。促卵泡生成激素(FSH)是垂体前叶嗜碱性细胞分泌的一种糖蛋白激素,其主要功能是促进卵巢的卵泡发育和成熟。由卵巢的黄体分泌,主要功能是促使子宫内膜从增殖期转变为分泌期。雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)与乳腺癌和子宫内膜癌相关,在乳腺癌组织中雌、孕激素受体状况是判断乳腺癌和子宫内膜癌预后及给予激素治疗的重要依据。雌、孕激素受体的检测用于指导乳腺癌的内分泌治疗,已在临床上广泛采用并取得了显著的疗效,改善了乳腺癌和子宫内膜癌患者的预后。因此把乳腺癌等依赖性激素靶器官肿瘤称为性激素依赖性肿瘤。不仅如此,在非性激素靶器官的肿瘤组织中存在性激素受体,以往研究表明正常人及肺癌患者的肺组织中均存在性激素受体,肺癌组织中的性激素受体水平明显高于正常人,提出肺癌也是性激素依赖性肿瘤。雌激素受体存在两个亚型,为雌激素受体α(ERα)和雌激素受体β(ERβ)。在以往研究中ERα在肺癌中表达还存在争议,但大部分认为ERα在肺癌中表达不明显,肺癌肿瘤中主要表达为ERβ。ERβ在肺癌的发生发展中具有重要作用,特别在以性别作为影响因素性激素依赖性肿瘤中具有重要影响。雌激素及其受体在肿瘤中作用机制可能为:雌激素进入肿瘤细胞质以后和特异性受体结合,形成激素受体复合物。激素受体复合物可以穿过核膜,进入细胞核,和核内受体结合并单体二聚化。从而影响细胞核中脱氧核糖核酸(DNA)的转录,合成了新的蛋白质,形成了新的肿瘤。虽然抗雌激素治疗在体外实验或动物实验中取得良好效果。但是,大部分女性肺癌患者给予抗性激素治疗后,并没有得到较好的疗效和取得更长的生存时间,这成为靶向抗雌激素治疗不足。可能为性激素依赖型肺癌患者的判断和筛选条件影响了此类患者的治疗。这样,对性激素依赖型肺癌判断和筛选条件成为首要研究方向。通过研究我们发现ERβ可能是性激素依赖性女性肺癌的一个重要因素。同时绝经前雌激素升高和绝经后孕激素的降低也可能是性激素依赖性肺癌的一个重要因素。通过合成针对ERβ的si RNA并构建与之相应的载体,对生长期培养的ERβ高表达的的细胞株LTEP-a2进行转染,对比阴性对照组和空白对照组;RT-PCR检测转染细胞ERβm RNA的表达,Western blot法检测ERβ蛋白的表达。噻唑蓝比色法(MTT法)检测雌激素培养的转染的细胞生长,流式细胞仪检测培养的转染的肺癌细胞的凋亡情况。在体外试验中佐证了ERβ可能是性激素依赖性肺癌的一个重要因素。通过抗性激素治疗效果作为判断女性性激素依赖性肺癌的依据,探讨其与一般情况及病理学因素之间的相互关系,筛选女性非小细胞肺癌性激素依赖性患者的影响因素。单因素分析筛选出与女性性激素依赖性肺癌相关因素,Logistic回归分析进一步筛选判断。肺癌发生发展是一个复杂的过程,性激素依赖性女性肺癌提出也是一个新的课题。针对性激素和相关受体及其相关机制的研究,有助于实现肺癌个性化诊断和治疗。本研究尝试从不同方面寻找此类患者的筛选条件,为女性非小细胞肺癌提供一种新的治疗方法。本研究包括以下四个部分章节第一部分:女性非小细胞肺癌患者雌激素受体的表达及其临床意义目的:检测女性非小细胞肺癌患者雌激素受体表达,研究其与病理学因素及术后生存率的关系,探讨女性非小细胞肺癌患者雌激素受体表达的临床检测价值。方法:应用免疫组化法检测2007年3月至2012年05月江门市中心医院手术的125例女性非小细胞肺癌患者肿瘤标本中雌激素受体ERα和ERβ,孕激素受体A(PRA)和孕激素受体(PRB)表达,分析其影响因素。Kaplan-Meier生存曲线比较生存率。结果:1.125例非小胞肺癌患者ERα阳性0例,所有肺癌肿瘤细胞未发现ERα阳性。125例非小胞肺癌患者ERβ阳性58例,阳性率为46.4%。2.125例非小胞肺癌患者PRA阳性0例,PRB阳性0例,所有肺癌肿瘤细胞未发现PRA阳性和PRB阳性。3.ERβ阳性表达与年龄大小、绝经前后状态、肺癌的病理类型、分期有关,其中腺癌的阳性率最高,鳞癌的阳性率最低。随着分期增高,ERβ阳性表达也越高(P<0.05)。ERβ阳性表达与肿瘤大小、分化程度、有无吸烟史无显著差异(P>0.05)。4.绝经前ERβ阴性患者生存率明显高于绝经前ERβ阳性女性非小细胞癌(P<0.05);绝经后ER?阳性生存率明显高于绝经后女性非小细胞肺癌(P<0.05)。结论:1.检测女性非小细胞肺癌患者雌激素受体表达具有重要意义,可以有助于了解女性患者的术后生存情况,给此类患者术后综合治疗提供综合判断。2.肿瘤组织雌激素受体ERβ水平可以影响女性非小细胞肺癌生长和术后生存,可能是女性性激素依赖性非小细胞肺癌筛选的一个重要因素。第二部分:女性非小细胞肺癌患者外周血性激素水平与癌组织雌激素受体表达的关系目的:女性非小细胞肺癌患者呈现增多和年轻化的趋势,研究表明肺癌也为性激素依赖性肿瘤,性激素在女性非小细胞肺癌发生发展中具有重要影响。研究女性非小细胞肺癌患者癌组织中雌激素受体β表达与外周血性激素水平,探讨其相关性及其临床意义。方法:应用磁性微粒分离的免疫酶联分析检测2006年3月至2012年05月中山大学附属江门医院手术的94例绝经前和128例绝经后女性非小细胞肺癌患者外周血性激素雌二醇(E2),卵泡生成激素(FSH),黄体生成激素(LH),孕酮(P)水平,术后免疫组化法检测肿瘤标本中雌激素受体ERβ表达,分析其相互关系。结果:1.绝经前94例女性非小细胞肺癌患者ERβ表达阳性为36例,阳性率为38.29%;绝经后128例女性非小细胞肺癌患者ERβ表达阳性为47例,阳性率为36.72%。2所有女性患者孕激素受体PRA和PRB均为阴性,阳性率为0。3.绝经前女性非小细胞肺癌患者血清E2正常组中79例患者54例ERβ无明显表达,25例等级表达;升高组中15例患者4例ERβ无明显表达,11例等级表达。绝经前女性非小细胞肺癌患者血清E2正常组和升高组之间雌激素受体β表达有统计学意义(p<0.05)。4.绝经前女性非小细胞肺癌患者血清FSH、LH正常组和升高组雌激素受体表达无差异。血清P正常组和降低组雌激素受体表达无差异(p>0.05)。5.绝经后女性非小细胞肺癌患者血清P正常组中107例患者75例ERβ无明显表达,32例等级表达;降低组中21例患者6例ERβ无明显表达,15例等级表达。绝经后女性非小细胞肺癌患者血清P正常组和降低组雌激素受体表达有统计学意义(p<0.05)。6绝经后女性非小细胞肺癌患者血清E2、FSH、LH正常组和升高组雌激素受体表达无差异。(p>0.05)。结论:1.女性非小细胞肺癌患者外周血存在性激素代谢的紊乱和失衡。2.绝经前雌激素异常可能影响雌激素受体表达,绝经后孕激素异常可能影响雌激素受体表达。3.无论绝经前期还是后期,LH和FSH激素的变化和肿瘤内雌激素受体表达无差异。4.绝经前血清中雌激素升高影响和绝经后孕激素降低都可以影响雌激素受体表达,可能为性激素依赖性肺癌的一个影响因素。第三部分:女性性激素依赖性肺癌的筛选因素目的:通过抗性激素治疗效果作为判断女性性激素依赖性肺癌的依据,探讨其与患者一般情况及病理学因素之间的相互关系,筛选女性非小细胞肺癌性激素依赖性患者的影响因素。方法:2007年8月至2014年8月中山大学附属江门医院治疗的女性非小细胞肺癌患者,肿瘤进展后给予他昔莫芬治疗,如果有效判定为性激素依赖性肺癌入A组(29例);进展后给予他昔莫芬治疗无效或加重,判定为肿瘤非依赖性肺癌入B组(83例),单因素分析筛选出与女性性激素依赖性肺癌相关因素后,Logistic回归分析进一步筛选判断。结果:女性性激依赖性肺癌与患者年龄、肿瘤分化程度、经期时间、吸烟状况、初潮年龄、月经周期差异无统计学意义(p>0.05),肿瘤类型、婚姻状况、雌激素受体表达、是否绝经、生产次数与女性性激依赖性肺癌差异有统计学意义(p<0.05)。采用多因素Logistic回归模型分析,结果示肿瘤类型、婚姻状况、雌激素受体表达、是否绝经、生产次数与女性性激依赖性肺癌差异有统计学意义(P<0.05)。结论:肿瘤类型特别是腺癌、婚姻状况、雌激素受体β表达、是否绝经、生产次数可能是女性性激素依赖性肺癌的筛选因素。第四部分:si RNA介导ERβ基因沉默对ERβ高表达的LTEP-a2细胞凋亡的影响目的:研究si RNA(Small Interference RNA)介导ERβ基因沉默对ERβ高表达的的LTEP-a2培养细胞凋亡作用及其对17-β雌二醇敏感性。方法:合成针对ERβ的si RNA,对生长期培养的ERβ高表达的的LTEP-a2细胞进行转染,对比阴性对照组和空白对照组;RT-PCR检测ERβm RNA的表达,Western blot法检测ERβ蛋白的表达。噻唑蓝比色法(MTT法)检测17-β雌二醇培养的转染细胞的存活情况,确定IC50,流式细胞仪检测培养的转染的肺癌细胞的凋亡。结果:1.转染si RNA组ERβm RNA表达明显低于阴性对照组及空白对照组(P<O.05)。阴性对照组及空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。2.转染si RNA组ERβ蛋白表达低于阴性对照组及空白对照组(P<O.05)。阴性对照组和空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)3.噻唑蓝比色法(MTT法)结果表明不同浓度的17-β雌二醇干预后,ERβ-si RNA转染组细胞与阴性对照组及空白对照组相比存活率出现显著下降。(P<O.05),雌二醇干预对LTEP-a2细胞生长与阴性对照组及空白对照组相比,转染组生长明显抑制(P<O.05)4.转染si RNA组在雌二醇干预后LTEP-a2细胞的凋亡率显著增加,转染组与阴性对照组与空白对照组比较,差异有显著性(35.68±1.58%,3.55±0.33%,2.34±0.58%,P<O.05)。结论:1.si RNA介导的ERβ基因沉默可以抑制雌激素药物干预后肺癌细胞的增殖。2.si RNA介导的ERβ基因沉默可以增加雌激素药物干预后肺癌细胞的凋亡。3.ERβ-si RNA可能为性激素依赖型肺癌治疗的新的靶点。4.ERβ可能在筛选女性性激素依赖型肺癌非小细胞肺癌中发挥重要作用并且对这些肺癌加以鉴定,为此类肺癌综合治疗提供帮助。