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目的:本研究通过体外实验,观察小檗碱(Berberine,BBR)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)分泌的影响,探究小檗碱预处理的骨髓间充质干细胞分泌液对氧化损伤的神经元的保护作用及抗凋亡、抗氧化损伤作用,并进一步阐明其作用及机制,从而为AD的防治探索一种新的有效治疗方法和途径。方法:(1)体外培养C57BL/6小鼠的原代BMSCs,利用流式细胞术以及成骨、成脂诱导分化进行鉴定。(2)CCK-8法确定BBR不损伤BMSCs的最佳药物浓度。(3)BBR作用于BMSCs 24 h后,收集继续无血清基础培养液(D/F12)培养后不同时间点(6 h、12 h、24 h、48 h)的分泌液,ELISA法检测NGF(神经生长因子)浓度最高的分泌液为最佳收取时间点。(4)实验分为D/F组(无血清D/F12培养液)、BMSC-CM组(无血清D/F12培养12 h的分泌液)、BBR-BMSC-CM组(BBR作用于BMSCs 24 h后,用无血清D/F12培养12 h的分泌液),ELISA法检测三组的分泌液中NGF和BDNF(脑源性神经营养因子)的含量并收取分泌液。(5)培养C57BL/6J小鼠的原代神经元细胞,通过免疫荧光鉴定第7天原代皮质神经元的微管蛋白(MAP2)。(6)MTT法确定t-BHP诱导神经元损伤至百分之五十的浓度和BBR-BMSC-CM改善t-BHP诱导的神经元损伤的最佳体积百分比。(7)正式实验分为5个组:Control组(神经元+Neurobasal)、t-BHP组(神经元+t-BHP+Neurobasal)、D/F组(神经元+D/F12+t-BHP+Neurobasal)、BMSC-CM组(神经元+BMSC-CM+t-BHP+Neurobasal)和BBR-BMSC-CM组(神经元+BBR-BMSC-CM+t-BHP+Neurobasal),MTT法检测不同情况处理后,各组神经元细胞的活性。(8)以DCFH-DA为原位探针免疫荧光和流式细胞术检测五组神经元细胞ROS的表达情况。(9)通过JC-1探针的免疫荧光和流式细胞术检测五组神经元细胞线粒体膜电位的改变。(10)利用Annexin V-FITC和PI的免疫荧光和流式细胞术双染检测五组神经元细胞的凋亡情况。(11)通过Western blot分别检测五组神经元凋亡相关蛋白(Cleaved-Caspase3/Caspase 3,Cytochrome c,Bax/Bcl-2),突触功能蛋白(SYP,PSD 95),通路相关蛋白(Keap1,Nuclear Nrf2,Cytosolic Nrf2,HO-1)的表达情况。结果:(1)流式细胞术检测第四代BMSCs免疫表型,结果显示:Sca-1、CD 105、CD 29呈阳性表达,CD 45呈阴性表达。经成骨或成脂分化诱导后,分别进行茜素红和油红“O”染色,镜下可见钙化结节和大量脂滴沉积形成。(2)当BBR是10μM,BMSCs的细胞活力最高,因此10μM为最佳药物浓度。(3)BBR-BMSC-CM组12 h时间点收集的分泌液NGF含量最高。(4)12 h收集的分泌液中,BBR-BMSC-CM组NGF和BDNF含量明显高于BMSC-CM组。(5)荧光显微镜下神经元微管蛋白被MAP2绿色荧光标记。(6)当t-BHP为10μM时,神经元损伤程度至50%,含有10%BBR-BMSC-CM分泌液改善神经元细胞活性效果最佳,神经元细胞活力最高上调至71%。(7)将各组细胞活性进行比较,t-BHP组明显下降,与BMSC-CM组相比,BBR-BMSC-CM组神经元细胞活力增高更显著。(8)t-BHP组ROS荧光水平明显增高,BMSC-CM组和BBR-BMSC-CM组绿色荧光强度明显低于t-BHP组,BBR-BMSC-CM组ROS荧光水平低于BMSC-CM组。(9)氧化损伤导致t-BHP组神经元中的线粒体膜电位降低,与t-BHP组相比,BMSC-CM组和BBR-BMSC-CM组明显线粒体膜电位升高,且BBR-BMSC-CM组较BMSC-CM组更高。(10)t-BHP造成神经元凋亡,与t-BHP组相比,BBR-BMSC-CM组神经元细胞凋亡数量显著减少,而BMSC-CM组神经元细胞凋亡数量减少不明显。(11)Western blot结果显示:与t-BHP组相比,BMSC-CM组和BBR-BMSC-CM组中,常见的凋亡蛋白Bax/Bcl-2,Cytochrome c,Cleaved-Caspase 3/Caspase 3均下调,SYP和PSD 95蛋白表达增加,Keap1,Cytosolic Nrf2蛋白含量下调,Nuclear Nrf2,HO-1蛋白含量上调,且BBR-BMSC-CM组效果更加明显。小结:(1)小檗碱明显促进BMSCs分泌神经营养因子NGF和BDNF;(2)小檗碱预处理BMSC的分泌液能够保护神经元、对抗t-BHP诱导原代皮质神经元损伤,比单纯BMSC分泌液效果更好;(3)BBR-BMSC-CM能减少ROS产生、逆转神经元中MMP的和减轻神经元氧化应激导致的细胞凋亡;(4)小檗碱预处理BMSC的分泌液明显下调Bax/Bcl-2,Cytochrome c,Cleaved-Caspase3/Caspase 3凋亡蛋白,减轻神经元凋亡;(5)明显上调SYP、PSD95突触蛋白的表达,减少神经元突触损伤;(6)BBR-BMSC-CM对抗神经元氧化损伤的机制可能是通过激活Keap1-Nrf2-HO-1信号通路实现的。结论:实验结果证实小檗碱能明显促进BMSCs分泌神经营养因子NGF和BDNF,并且小檗碱预处理的BMSCs分泌液比单纯BMSCs分泌液能更有效的恢复氧化损伤的神经元细胞活力,改善线粒体功能障碍、减少神经元凋亡和氧化损伤。进一步表明实验结果对抗氧化损伤的作用可能是通过Keap1-Nrf2-HO-1抗氧化信号途径抑制了ROS的产生而实现的。