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研究背景及目的骨髓微环境是以基质细胞为主体，多种粘附分子和生长、趋化因子共同参与的三维结构体，其功能发挥需要多细胞、多因子的复杂网络体系的共同作用。其中基质细胞本身即是一个包含了成骨细胞、成纤维细胞、内皮细胞、组织细胞等的细胞复合体。在相当长的时间内，骨髓微环境的研究只是笼统的以体外培养骨髓基质细胞为对象，观察其粘附及分泌功能的变化是否对共培养的白血病细胞产生影响。自从1978年Schofield首先将“龛”的定义引入骨髓用来描述造血干细胞的微环境后，近年来学者采用不同的技术方法在动物体内研究了造血细胞龛在对造血干细胞生理功能维持中的作用。Purton等研究发现造血干细胞主要依靠成骨细胞和血管内皮细胞两种成分实现自我更新和多向分化，其中成骨细胞是成骨细胞龛的主要组成部分，它局限于骨髓腔内表面，起到储存长期培养造血干细胞并维持其生理功能的作用。在造血损伤恢复和骨髓移植模型中骨内膜的成骨细胞周围通常聚集着数量丰富的造血前体细胞。正常造血情况下，成骨细胞龛可以支持造血干/祖细胞及长期培养启动细胞的长期存活。急性髓系白血病的形成和发展与白血病异常的骨髓造血微环境密切相关，但白血病骨髓异常造血微环境的形成及在白血病细胞恶性造血中的作用机制尚不完全清楚。在白血病异常造血微环境中成骨细胞龛成为部分白血病细胞特别是白血病干/祖细胞定植、增殖的场所。静止期白血病细胞休眠于成骨细胞龛内以躲避理化因素的杀伤，并最终成为白血病化疗后耐药和复发的发源地。Hiroki等研究发现具有c-MPL高表达的G0期造血干细胞均与成骨细胞紧密相连，造血干细胞静止于这些龛位中免受理化因素的影响，在应激情况下能够进入细胞周期，维持造血系统的正常运行。Yamazaki等通过阻断TPO/c-MPL通路发现G0期长期培养造血干细胞数量明显减少，认为TPO/c-MPL信号通路对于造血干细胞龛中的造血干细胞的自我更新及Go期的维持起到了重要作用。血小板生成素（Thrombopoietin，TPO）与其受体c-MPL相互作用是促进巨核细胞增殖、增加外周血血小板的数量的主要调节途径，近年来的研究发现骨髓基质细胞中成骨细胞具有分泌TPO的功能，而c-MPL不仅表达于不同成熟阶段巨核细胞、早期造血干、祖细胞，在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）、慢性粒细胞白血病（chronic myelocytic leukemia，CML）及骨髓增生异常综合症（chronic myelocyticleukemia，MDS）患者的原始细胞中也均有较高表达。鉴于成骨细胞分泌TPO的功能以及AML细胞c-MPL的高表达，本实验在国家自然基金的支持下，首先检测了初发及复发AML患者骨髓TPO及其受体c-MPL的表达，探讨白血病难治复发与TPO/c-MPL表达水平之间的关系；然后在成功诱导骨髓间充质干细胞成骨分化，并分别检测成骨细胞TPO分泌和AML细胞株HEL细胞c-MPL表达的基础上，通过体外构建成骨细胞与AML细胞株二维共培养体系，探讨TPO/c-MPL信号通路在成骨细胞龛庇护白血病细胞免受化学药物杀伤中的作用，并观察共培养条件下白血病细胞株对化疗药物敏感性的变化，为后续在三维成骨细胞龛内检测阻断TPO/c-MPL信号通路后对AML影响的深入研究奠定实验基础。研究方法第一部分：AML患者骨髓TPO及受体c-MPL的表达及其意义1．AML患者及对照组骨髓单个核细胞样本的制备2．流式细胞仪检测AML患者白血病细胞及对照组骨髓单个核细胞c-MPL的表达3．ELISA法检测AML患者及对照组骨髓上清TPO水平第二部分：不同来源成骨细胞TPO分泌及AML细胞株c-MPL表达的研究1．AML患者及对照组骨髓间充质干细胞诱导向成骨细胞分化及其鉴定2．成骨细胞株hFOB1.19及白血病细胞株HEL及DAMI细胞的体外培养3．流式细胞仪检测白血病细胞株HEL和DAMI c-MPL的表达分析4．ELISA法检测分离的骨髓单个核细胞、不同来源骨髓间充质干细胞及其诱导分化的成骨细胞、hFOB1.19细胞TPO分泌水平第三部分TPO/c-MPL通路对骨髓微环境庇护AML细胞作用的探讨1．AML细胞株HEL与不同来源成骨细胞二维共培养体系的建立2．不同浓度柔红霉素在体外共培养24H时各培养组HEL细胞株存活率的检测结果1．AML复发及初发患者骨髓单个核细胞c-MPL均有较高表达，明显高于对照组(P<0.05)，复发患者c-MPL表达明显高于AML初发患者水平（P<0.05）；初发患者化疗缓解后可降至正常水平(P>0.05)。2．ELISA法检测发现AML初发患者骨髓上清TPO表达水平高于对照组(P<0.05)，AML复发患者明显高于初发患者(P<0.05)，初发患者化疗缓解后与正常骨髓TPO表达无明显差异(P>0.05)。3．成功进行了AML患者骨髓间充质干细胞体外培养鉴定、向成骨细胞诱导分化以及成骨细胞株hFOB1.19、急性髓系白血病细胞株HEL体外培养。4．骨髓间充质干细胞成骨诱导过程中TPO表达逐渐增多，同一诱导时相点AML骨髓诱导的成骨细胞表达水平高于正常骨髓诱导的成骨细胞(P<0.05)，成骨细胞株hFOB1.19细胞体外培养能够分泌TPO。5．HEL细胞株c-MPL表达率为8.32%，DAMI细胞株c-MPL表达率为6.10%。6．共培养24h时各组中HEL不同柔红霉素浓度作用下存活呈横S状，符合药物作用一般规律，其中HEL+AML来源成骨细胞各浓度下细胞存活率最大，HEL单独培养组细胞存活率最低， HEL+hFOB1.19组与HEL+正常来源成骨细胞存活率无明显差异。7．采用spss13.0软件计算各培养组中柔红霉素IC50值，A组HEL单独培养组IC50为（1.643±0.108）ug/ml,D组HEL+AML来源成骨细胞为（3.320±0.218）ug/ml，C组HEL+正常来源成骨细胞为（2.236±0.167）ug/ml，B组HEL+hFOB1.19组IC50为（2.254±0.111）ug/ml，A组中DNR明显低于其他共培养组(P＜0.05)，D组明显高于其他组(P＜0.05)，B组和C组无差异(P>0.05)。结论1．TPO及c-MPL的高表达对AML的诊断具有提示意义。TPO及c-MPL在复发患者骨髓细胞的表达较AML初发患者明显增高，提示TPO/c-MPL信号通路的高表达可能与急性髓系白血病治疗后复发及难治相关。2．AML骨髓间充质干细胞诱导的成骨细胞TPO表达水平明显高于对照组骨髓所诱导的成骨细胞及hFOB1.19成骨细胞株；AML细胞株c-MPL表达较高，尤以HEL细胞增高明显。3．成骨细胞与AML白血病细胞体外共培养对白血病细胞株免受化疗药物的杀伤具有保护作用，高表达c-MPL的AML骨髓诱导的成骨细胞对白血病细胞的庇护作用更强。4．上述研究提示TPO/c-MPL信号通路可能作为难治复发性AML新的治疗靶点。