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背景白细胞介素35(Interleukin 35,IL-35)是最新发现的白细胞介素12(IL-12)细胞因子家族成员。IL35可能在自身免疫性疾病,炎性疾病,感染性疾病以及某些肿瘤中具有重要的作用,可能成为治疗这些疾病的新靶点。在我们的前期研究中发现,与正常组织及细胞系比较,胰腺癌组织及细胞高表达IL-35蛋白。我们设计本实验,进一步明确IL-35在胰腺癌组织及细胞中的表达方式;从临床水平、细胞水平及动物实验水平探索胰腺癌肿瘤源性IL-35的功能及其调控机制。方法1.应用胰腺癌组织石蜡标本,进行IL-35两个亚基p35和EBI3及IL-35受体两个亚基IL12rβ2和gp130的连续切片免疫组化染色,分析IL-35及其受体的表达水平及相关性;搜集病例资料进行预后随访,分析IL-35及其受体的表达水平与临床病理参数之间的关系。2.应用Western blot、RT-PCR、ELISA等实验技术检测胰腺癌5个细胞系、Treg细胞(作为阳性对照)以及正常胰腺导管细胞系的IL-35及其受体的表达水平;应用免疫荧光技术检测IL-35及其受体共4个亚基在胰腺癌细胞中的表达细胞定位;应用免疫共沉淀技术(Co-Immunoprecipitation,COIP)研究胰腺癌细胞表达IL-35两个亚基的相关性。3.应用分子克隆方法构建IL-35过表达质粒及IL-35 shRNA降表达质粒,构建慢病毒稳定转染系统,建立稳定转染细胞系;用Western blot、RT-PCR及ELISA检测所构建稳系表达IL-35水平;应用EDU增殖实验检测所构建细胞表达的IL-35的生物学功能。4.用人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)粘附实验及跨内皮迁移(Transendothelial migration,TEM)实验研究IL-35在体外促肿瘤细胞出血管过程。应用转录组测序的方法筛选IL-35促进肿瘤转移的靶标;应用Western blot及RT-PCR实验验证测序结果;通过阻断试验进一步确定IL-35促肿瘤出血管过程的靶标。5.应用Western blot、RT-PCR、CHIP及免疫荧光实验检测IL-35调控靶标的分子机制。6.构建nod-sci小鼠肿瘤细胞出血管过程模型;构建nod-scid小鼠胰腺癌原位成瘤模型;体内验证il-35促胰腺癌细胞出血管及促进胰腺癌转移作用。结果1.il-35及其受体在胰腺癌组织中的表达及其意义。通过对123例胰腺癌组织标本进行免疫组化染色发现,il-35两个亚基p35及ebi3的表达在多种胰腺癌病理类型表达阳性,而对应的正常胰腺组织不表达或弱表达;分析p35及eib3表达的相关性,发现两者的分布呈明显相关性(r=0.950;p<0.0001);将p35及ebi3都高表达的定义为il-35高表达,其他的为il-35低表达,我们发现il-35高表达的占48.8%(60例);我们进一步探索il-35表达水平与临床病理参数的关系,发现高il-35水平与较晚tnm分期、淋巴结受累以及血管侵犯相关(p值分别为0.01,0.027及0.007)。我们发现较高的il-35表达水平患者具有较差的总生存期(中位数:13.70±0.722vs18.5±1.50月)及较差的无复发生存期(中位数:11.39±0.54vs16.87±2.00);cox风险模型经过单因素、多因素分析后得出il-35表达水平是总生存期及无复发生存期的独立影响因素。il-35受体两个亚基gp130及il12rβ2在胰腺癌组织中均有阳性表达。进一步研究了il-35配体及受体表达的相关性,发现两者明显正相关(r=0.384,p<0.0001)。我们将il-35配体及受体综合考虑分组后发现,il-35高表达同时受体表达阳性的患者的总生存期及无复发生存期较其他组的差;这些结果提示il-35在体内通过自分泌或旁分泌作用直接作用于胰腺癌细胞而发挥生物学功能,引起肿瘤进展。2.il-35及其受体在胰腺癌细胞系中的表达。rt-pcr、westernblot、免疫荧光实验及elisa实验发现5个胰腺癌细胞系(panc-1、miapaca-2、cfpac-1、aspc-1及bxpc-3)均表达il-35及其受体;在miapaca-2及cfpac-1细胞中用coip实验证实了il-35两个亚基的结合。3.成功构建了2个过表达il-35的胰腺癌细胞系(panc-1及bxpc-3)和降表达il-35的两个细胞系(miapaca-2和cfpac-1);经cd4+t细胞体外edu增殖实验证实,构建的il-35稳系具备有文献报道的抑制cd4+t细胞增殖的生物学功能。4.体外功能实验证实肿瘤细胞过表达il-35后,huvec粘附及tem能力增强;而肿瘤细胞降表达il-35后huvec粘附及tem能力下降。转录组测序发现IL-35过表达后细胞间粘附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM1)表达水平明显上调,Western blot实验验证了ICAM1表达水平受IL-35的调控;瓶颈试验发现,当将过表达IL-35细胞的ICAM1分子下调后,该细胞系的HUVEC粘附及TEM能力不再有明显的增强。ICAM1抗体能部分阻断发现IL-35过表达引起的HUVEC粘附能力增强。5.肿瘤细胞受到IL-35蛋白刺激后JAK-STAT信号通路被激活,磷酸化STAT1(p-STAT1)及磷酸化STAT4(p-STAT4)表达水平明显上升,并且在细胞核内可见p-STAT1及p-STAT4聚集。IL-35是通过gp130:gp130同源受体,激活P-STAT1:P-STAT1同源二聚体入核后激活人PDAC细胞ICAM1表达的。6.体内出血管实验发现IL-35通过调控ICAM1的表达,促进了Pan02细胞出血管过程;体内胰腺原位成瘤实验发现IL-35通过调控ICAM1的表达,促进了肿瘤的转移。7.IL-35能诱导人胰腺癌细胞的EBI3及p35基因的自激活,促进IL-35表达水平增加,提高IL-35阳性肿瘤细胞的比率。提高了胰腺癌细胞中IL-35的表达强度及表达广度,诱导了肿瘤转移潜能的播散。结论1.IL-35蛋白及其受体在胰腺癌组织及细胞系中异常过表达;胰腺癌组织IL-35表达水平较高的患者预后较差。2.IL-35过表达后将激活JAK-STAT信号通路,促进p-STAT1:p-STAT1同源二聚体的生成,入核后通过上调ICAM1的表达,从而增强胰腺癌细胞的HUVEC粘附能力及TEM能力。通过促进肿瘤细胞血管粘附及出血管过程进而增强肿瘤的转移能力。3.IL-35能促进人胰腺癌细胞IL-35基因的自激活,进一步促进了肿瘤的转移能力。