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酪蛋白巨肽是人乳中K-酪蛋白C端的一个多肽片段,由64个氨基酸组成。它富含人体必需的基本氨基酸和支链氨基酸,因此它可以用作保健品和为特殊病人提供营养。本实验将利用聚合酶链式反应(PCR)克隆人源酪蛋白巨肽基因,并在大肠杆菌中进行原核表达。选用大肠杆菌的偏爱密码子化学合成法合成编码酪蛋白巨肽(hCMP)片段的DNA,在其基因的5’端和3’端引入Bam H I和Sac I位点。将PCR产物连接到表达载体pET-28a(+)七,构建重组表达载体pET-28a(+)-hCMP.将重组载体pET-28a(+)-hCMP转化E.coli DH5a。基因测序证明基因序列与理论相符。pET-28a(+)-hCMP转化E. coli BL21(DE3),分别研究不同诱导温度、不同诱导时间、不同IPTG浓度、不同kan浓度和不同乳糖浓度对融合蛋白表达的影响,单因素实验结果表明,诱导前温度30℃,诱导后温度37℃时蛋白表达量最高。随时间的增加蛋白表达逐渐增加,4h融合蛋白表达量最高可占细菌总蛋白的57.51%。IPTG在较低浓度时有利于融合蛋白hCMP在表达菌中的表达,当IPTG浓度为0.2mM/L融合蛋白量最高。Kan浓度的变化对融合蛋白表达量无显著影响。乳糖可使E.coli BL21(DE3)的生长速度加快,浓度大于1%时融合蛋白表达量下降。然后采用正交试验对E.coli BL21(DE3)的培养条件进行研究,得出了优化后的发酵条件：诱导时间37℃,IPTG浓度为0.2mM/L,诱导时间8h,Kan浓度100mg/L。在此条件下,融合蛋白表达量可占细菌总蛋白的62.8%。E. coli BL21(DE3)表达菌渗透休克、超声波裂解后电泳,结果表明,融合蛋白大部分存在于细胞质和细胞周质中,包涵体中无融合蛋白存在。采用Ni-Sepharose亲和层析柱分离纯化hCMP,当咪唑浓度为300mM/L时,可达到较好的分离效果。重组蛋白经肠激酶酶切后,先经Ni-Sepharose亲和层析除去残留肽,然后经Sephadex G-10凝胶层析柱纯化,得到纯度达97%的hCMP,产量达25mg/L。Western-Blot鉴定证明大肠杆菌表达的融合蛋白符合预期结果,为人源酪蛋白巨肽。MALDI-TOF-MS进一步鉴定重组蛋白,并得到蛋白N端序列为IAIPPKK。本实验构建了人源酪蛋白巨肽重组表达质粒pET-28a(+)-hCMP,表达出6.7KD未糖基化的hCMP,经鉴定符合预期结果。从而,为大批量制备未糖基化hCMP提供了一个新方法。