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目的: (1)研究体外高纯度Wistar乳鼠施万细胞(SCs)的培养方法;(2)研究SCs与壳聚糖支架的组织相容性;(3)将BDNF基因转染的SCs注入预制壳聚糖导管,构建组织工程人工神经桥接Wistar大鼠10mm坐骨神经缺损,研究此人工神经桥接体的修复效果及这些促神经再生因素之间的相互作用,为组织工程神经的进一步研究和临床应用提供实验依据。方法: (1)取3-5d的Wistar乳鼠双侧坐骨神经、臂丛神经,用酶消化后组织块种植法培养SCs。用0.25%的胰蛋白酶常规消化、2次25分钟差速贴壁法纯化SCs,经过1周培养,长满瓶底后,加入0. 25%的胰蛋白酶常规消化分瓶传代, S-100免疫组化染色计算SCs纯度。(2)取上述SCs制成悬液,密度为1×105/ml。24孔培养板2个,分为正常对照组和实验组,壳聚糖膜平铺于孔底。SCs接种到培养板内,在37℃和5%CO2的条件下培养。培养24h后,培养液中加入DAPI(终浓度50μg/ml)孵育过夜后液,PBS洗涤培养瓶至少3次,以去除未与细胞结合的DAPI。加培养液继续培养。观察SCs和壳聚糖组织相容性。(3)将1×105/ml BDNF基因转染的SCs接种到壳聚糖导管内,构建组织工程人工神经桥接体,桥接SD大鼠10mm坐骨神经缺损(A组),研究其修复效果。另设空白壳聚糖导管组(B组)、假手术组(C组)、自体神经移植组(D组)作为对照。在术后6, 12周进行实验动物的经电生理检测、组织学切片,光镜观察,评价其修复效果。结果: (1)用酶消化后组织块贴壁培养的的方法,SCs“爬出”速度较直接组织贴壁培养方法快,进一步纯化后做S-100细胞免疫组织化学鉴定为SCs,纯度达到95%以上。(2)SCs与壳聚糖支架的组织相容性:正常对照组和实验组各时点凋亡细胞的百分率经差异无显著性意义(P> 0.05)。(3)大体观察:饲养过程中无大鼠死亡,大鼠患肢屈曲挛缩情况及拖曳步态在6周以后有所改善。12周后大鼠处死,未见导管残留及桥接段上下神经萎缩,周围有血管增生、粘连现象。(4)电生理检测:四组NCV相互比较,A组与B组、A组与C组均有显著性差异(P<0.05),A组与D组无显著性差异(P>0.05)。组织学观察组织工程神经体内长期、稳定表达目的基因-BDNF和报告基因-GFP、FLAG。结论: (1)先用酶消化,后组织块贴壁培养SCs和差速贴壁综合运用的纯化方法所“生产”的SCs数量较大,纯度较高,且细胞的理化性质及生物学特性受外界环境影响较小。同时又节约了神经组织的材料来源,避免了反复多次取材的繁琐操作过程,节省人力和物力,并且保证了实验所需的SCs尽可能来源于同一只或同一批动物。(2)使用冷冻干燥技术研制的壳聚糖导管表面光滑,透明状,质地均匀。厚度0.15 mm,与盖玻片的厚度相仿。实验表明具有良好生物相容性,SCs可以在其表面生长增殖。可以作为神经桥接管。(3)用壳聚糖制作三维支架,以BDNF基因转染的SCs为种子细胞,构建成的组织工程化人工神经,修复神经缺损,其修复效果接近于自体神经移植,相对于单纯应用壳聚糖神经导管修复神经缺损可进一步提高神经修复的效果。具有广阔的应用前景,值的进一步研究。