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在十字花科芸苔属蔬菜中,硫代葡萄糖苷-黑芥子酶系统是一个重要的自我防御系统,也被称作“芥子油炸弹”。本论文对十字花科蔬菜类49菜心、包菜和芥兰中的黑芥子酶基因进行了克隆和分析。 本论文对十字花科蔬菜RNA提取的三种方法进行了比较,结果表明苯酚-氯仿法和Trizol法比UNIQ-10柱法更好,研究还表明十字花科蔬菜中RNA的丰度与不同昆虫的取食诱导有关。这为下一步的研究提供了基础。 根据已经克隆的黑芥子酶基因序列的保守区域,设计引物,利用一步法RT-PCR对49菜心、包菜和芥兰中黑芥子酶基因中间片段进行了克隆。在49菜心和包菜中扩增到一条(350bp)核酸片段,而在芥兰中扩增到两条(350bp和466bp)核酸片段。分别对克隆到的片段进行blast分析,得出克隆到的49菜心、包菜和芥兰中的350bp片段与Genbank上的黑芥子酶基因同源性很高(95%以上),可推断三条350bp片段都属于黑芥子酶基因。而芥兰中另一条466bp的片段blast结果表明在310到426之间与Genbank上黑芥子酶基因同源性不高。另外,还对克隆到的基因进行蛋白质翻译分析。 根据在49菜心中已经克隆到黑芥子酶基因片段,进行RACE引物设计,对49菜心中的黑芥子酶全基因(全cDNA)进行了克隆和测序。克隆结果表明所得到的1841bp是黑芥子酶基因,其中阅读框为1647bp。把所得到的黑芥子酶全基因进行mRNA二级结构预测,结果得出有83个突环结构影响mRNA的稳定性,最低结构能量是-33.61kcal。 把所得基因进行翻译后得到548个氨基酸序列。对蛋白的疏水性预测分析表明克隆到的黑芥子酶是亲水性的可溶性蛋白。对蛋白二级结构综合预测结果表明149(27.2%)个氨基酸发生α螺旋(Hh)、79(14.4%)个氨基酸发生β折叠(Ee)、281(51.3%)个氨基酸发生无规则卷曲(Cc)、39(7.1%)个氨基酸发生未知结构(?)。 利用黑芥子酶蛋白分析含黑芥子酶植物的进化关系,结果表明十字花科蔬菜芥兰、包菜、49菜心之间的亲源关系较接近。