环磷酸腺苷(cAMP)是广泛存在于生物体内的信号物质,作为第二信使,对蛋白质、脂质及核酸等物质代谢具有重要调节作用,在植物抗逆生长、临床治疗、畜牧业生产等方面具有广泛的应用。微生物以胞内ATP为底物在腺苷酸环化酶催化下直接环化合成产物,强化细胞能量代谢有利于cAMP合成。本文以节杆菌Arthrobacter sp.CCTCC2013431为生产菌株,试图通过添加不同辅助能量物质强化能量代谢,促进cAMP合成,并从发酵动力学、关键酶活性、辅因子水平、氨基酸代谢等方面进行分析,探讨产物得以显著提高的原因。通过呼吸链抑制剂鱼藤酮营造ATP合成不足的条件,验证了两种辅助能量物质可以通过强化能量代谢,将发酵性能回复到正常水平的可能性。主要研究内容和结果如下:(1)通过添加丙酮酸钠强化能量代谢促进cAMP发酵合成。通过摇瓶实验,确定发酵24 h添加3 g/L-broth丙酮酸钠为最适添加条件,并在7 L发酵罐中进行发酵实验。发酵50 h时cAMP产量达到最大值3.69 g/L,与对照相比提高25.94%,生产强度得到明显提高。通过对cAMP合成途径中关键酶活性测定,表明丙酮酸钠使糖酵解途径明显弱化,戊糖磷酸途径代谢强度得到显著提高,更多碳源用于产物合成。此外,丙酮酸钠的添加大幅提高了三羧酸循环的代谢强度,促进了 NADH的再生,伴随电子呼吸链效率的提高,促进ATP/ADP 比的提高,为cAMP的合成提供充足的能量基础。(2)基于六聚偏磷酸钠构建的ATP合成系统促进cAMP发酵合成。通过摇瓶实验,确定发酵24 h添加2 g/L-broth六聚偏磷酸钠为最适添加条件,并在7 L发酵罐进行发酵实验。发酵72 h时cAMP产量达到3.56 g/L,与对照相比提高21.50%。对关键酶活性、能量物质和氨基酸含量进行检测,结果表明,由于六聚偏磷酸钠的添加,胞内PPK活性得到明显提高,成功构建了基于低聚磷酸盐和PPK的ATP合成系统,显著提高了 ATP的供应能力,为cAMP的合成与积累提供了能量来源。在此基础上,结合cAMP从头合成途径的特点,提出六聚偏磷酸钠和天冬氨酸偶合添加的发酵工艺,进一步提高了 cAMP的产量。(3)通过辅助能量物质解决cAMP发酵生产中能量供应不足问题的研究。在36 h添加15 mg/L-broth鱼藤酮模拟能量弱化条件,并进行了补充辅助能量物质的发酵实验。通过对发酵动力学、细胞活性、能量物质水平、关键酶活性等进行分析,结果表明鱼藤酮的添加使细胞活性、ATP含量、cAMP产量等均得到一定程度降低,使cAMP发酵中能量供应不足的问题得到显现。通过补充丙酮酸钠和六聚偏磷酸钠,细胞活性、ATP含量和cAMP产量等明显提高,并达到与对照批次相当的水平。这对实际发酵生产中由突发情况导致的供氧不足以及能量供应问题的解决,提供了可参考的处理方法。