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肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是世界最常见癌症之一,发病率和死亡率居前列。肿瘤转移是导致其预后差、高复发、术后5年生存率低、死亡率高的主要原因。肿瘤细胞代谢异常在肿瘤转移中起重要作用,肿瘤细胞在有氧条件下以糖酵解为主要糖代谢途径提供能量,这种现象在转移性肿瘤中更突出。基于肝细胞在代谢中的基本作用,改变肝癌细胞糖代谢可作为一种治疗策略。肝癌糖代谢分子机制不清,对其分子机制进行深入研究,有助于发现新的诊疗靶点,改善肝癌患者的预后。CRKL是CRK信号蛋白家族中的一员,在真核生物中广泛存在和表达。它由一个N末端SH2结构域、一个N末端SH3和一个C末端SH3结构域组成。CRKL可通过直接与下游受体蛋白形成复合物来调节细胞酪氨酸激酶活性,也可作为信号起始的上游介质,在细胞信号级联反应中发挥作用,在细胞增殖、生存、粘附和迁移中起关键作用。CRKL异常表达与多种癌症发生和发展有关。我们前期发现:CRKL过表达和下调对肝癌Hep G2细胞体外迁移和侵袭有显著促进和抑制作用;在CRKL下调的慢粒白血病sh RNA-CRKL-K562细胞株中,基因芯片结果表明PI3K表达水平下调40.1%。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)由调节亚基p85和催化亚基p110构成,调节亚基含有两个重要的结构域SH2和SH3,与含有相应结合位点的靶蛋白相互作用。PI3K对细胞代谢有重要作用,改变PI3K的表达水平可影响代谢作用,包括葡萄糖转运、糖原及脂类合成。糖代谢作为肝癌细胞的重要代谢特征之一,其分子调控机制不明确。基于肿瘤恶性生物学行为与代谢紊乱的相互关系,我们推测CRKL可能参与调控肝癌异常糖代谢。CRKL对肝癌糖代谢功能的影响未见报道,其潜在调控肝癌细胞糖代谢作用及机制值得研究。本论文旨在研究CRKL是否通过PI3K信号通路影响肿瘤细胞的糖代谢,探讨CRKL与肝癌糖代谢间的关系及可能的调控机制。目的:1.检测CRKL、PI3K在肝癌样本和肝癌细胞中的表达水平与相关性;2.确定CRKL过表达对肝癌细胞糖代谢的影响;3.初步探究CRKL调控肝癌细胞糖代谢的分子机制;4.明确CRKL与PI3K相互结合及调控关系。方法:1.免疫印迹(Western blotting,WB)法检测肝癌样本及肝癌细胞中CRKL和PI3K的表达水平;2.葡萄糖氧化酶-过氧化物酶(glucose oxidase-peroxidase,GOD-POD)法检测CRKL过表达对HCCLM3和HuH7细胞葡萄糖消耗的影响;3.乳酸氧化酶法检测CRKL过表达对HCCLM3和HuH7乳酸生成的影响;4.过碘酸-希夫反应(periodic acid schiff reaction,PAS)染色法检测CRKL过表达对HCCLM3和HuH7糖原合成的影响;5.WB检测CRKL过表达对HCCLM3和HuH7细胞PI3K通路分子表达的影响;6.WB检测LY294002阻断PI3K,PI3K通路相关分子表达水平变化及HCCLM3和HuH7糖代谢水平的变化;7.免疫共沉淀法(co-immunoprecipitation,Co-IP)检测CRKL与PI3K是否直接结合。结果:1.10例肝癌样本中,8例样本CRKL呈高表达(72.8%,P=0.0356),8例样本PI3K呈高表达(74.5%,P=0.0422),CRKL和PI3K在肝癌样本中表达水平呈正相关(R~2=0.5381,P=0.0157);2.与人正常肝细胞LO2相比,CRKL在肝癌细胞Hep G2、HCCLM3和HuH7中表达水平显著升高(76.7%,P=0.0307)、97.7%,P=0.0042和65.6%,P=0.0134);PI3K在肝癌细胞Hep G2、HCCLM3和HuH7中表达水平显著升高(45.4%,P=0.0016、158.3%,P=0.0005和90.0%,P=0.0040),CRKL和PI3K在肝癌细胞中表达水平呈正相关(R~2=0.9074,P=0.0474)。3.在HCCLM3和HuH7中过表达CRKL,细胞葡萄糖消耗分别提高27.8%(P=0.0065)和21.9%(P=0.0313);乳酸在24 h的生成量提高160.7%(P=0.0013)和95.2%(P=0.0140);糖原合成反应呈阳性,糖原呈紫红色颗粒状,弥散分布于肝癌细胞胞质内,糖原含量丰富、颗粒清楚、分布均匀,糖原的合成有所增加。4.在HCCLM3和HuH7中过表达CRKL,PI3K水平分别升高52.3%(P=0.0070)和69.7%(P=0.0134),磷酸化蛋白激酶B(serine/threonine kinase,p-AKT)表达分别升高18.3%(P=0.0492)和27.3%(P=0.0170),己糖激酶II(hexokinase II,HKII)分别上调55.3%(P=0.0112)和30.6%(P=0.0086),葡萄糖转运体(glucose transporters 1,GLUT1)表达分别上调63.0%(P=0.0034)和52.0%(P=0.0214),糖原合成酶激酶(glycogen syntheses kinase3β,GSK3β)表达分别下调47.0%(P=0.014)和36.67%(P=0.0243)。5.CRKL过表达的HCCLM3和HuH7中,阻断PI3K,细胞葡萄糖的消耗分别减少124.0%(P=0.0043)和92.3%(P=0.0313);乳酸生成在24 h分别减少34.5%(P=0.0017)和32.3%(P=0.0140)、PAS阳性反应较弱,糖原颗粒浅并且少,并且分布不均匀,糖原含量明显减少;PI3K表达水平分别降低86.7%(P=0.0054)和81.6%(P=0.0001),p-AKT表达水平分别降低65.0%(P=0.0072)和30.7%(P=0.0086),HKII表达水平分别降低81.3%(P=0.0010)和87.3%(P=0.0005),GLUT1表达水平分别降低38.7%(P=0.0187)和62.3%(P=0.0025),GSK3β表达水平分别增加48.6%(P=0.0044)和36.0%(P=0.0202)。6.Co-IP结果表明CRKL与PI3K直接结合。结论:1.CRKL和PI3K在肝癌样本中高表达且两者表达水平呈正相关;2.CRKL和PI3K在肝癌细胞株中高表达且两者表达水平呈正相关;3.CRKL过表达增加肝癌细胞的葡萄糖的消耗、乳酸的生成、糖原的合成;4.CRKL通过激活PI3K/AKT通路促进肝癌细胞糖代谢。