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目的阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种无法治愈的进行性神经退行性疾病。淀粉样蛋白（amyloid-β,Aβ）的积累被认为是AD患者主要的病理学特征之一。目前,脑内Aβ清除不足被认为是引起AD散发性病例中Aβ聚集和神经元死亡的原因之一。Aβ清除可能涉及存在于大脑中的特定的蛋白酶或Aβ结合/运输蛋白。在淀粉样蛋白降解酶中,脑啡肽酶（Neprilysin,NEP）是研究最为深入的Aβ降解酶之一。NEP属于质膜糖蛋白中性锌金属内肽酶家族,是脑内主要的Aβ降解酶。衰老和AD往往伴随着NEP在大脑中的表达水平和活性的下降,但NEP基因表达的调节机制还不得而知。虽然特定基因的遗传变异增加了AD的风险,但年龄是AD已知的最强的致病因素。在许多物种中,衰老大脑的特点是基因表达的增加,但是,与年龄相关的认知能力下降与海马和额叶前皮层基因表达的下降有关,脑内这些改变可能与各种压力因素有关,如氧化应激、神经炎症、线粒体功能障碍、Ca2+稳态失衡等。组蛋白修饰等表观遗传学机制在基因表达的调节中起重要作用,本课题将研究年龄和衰老因素相关的NEP表达下调是否伴随着NEP基因的组蛋白修饰改变,以促进对衰老过程中NEP基因表达的表观遗传学调节机制的理解。方法1.体内实验:使用Western-blot检测不同月龄C57小鼠大脑皮层和小脑的NEP蛋白表达水平。应用Real-time RT-PCR方法检测不同月龄C57小鼠大脑皮层和小脑的NEP m RNA水平;皮层内炎症相关因子IL1-β,Arg-1和NOS2 m RNA水平。利用脂质过氧化产物试剂盒检测海马内丙二醛（MDA）的水平。使用Ch IP检测不同月龄C57小鼠大脑皮层NEP基因启动子区组蛋白的乙酰化和甲基化修饰。2.体外实验:利用神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞制备氧化应激和神经炎症模型。应用神经毒素MPP+碘化物处理SH-SY5Y细胞,建造氧化应激细胞模型。应用细菌脂多糖LPS处理原代培养的小胶质细胞,24小时后收集条件培养液处理SH-SY5Y细胞,制备神经炎症模型。使用Western-blot方法分别检测SH-SY5Y氧化应激和神经炎症模型中NEP蛋白表达水平,应用QPCR方法检测SH-SY5Y氧化应激模型中不同时间NEP m RNA水平,使用Ch IP检测SH-SY5Y氧化应激和神经炎症模型中NEP基因启动子区组蛋白的乙酰化和甲基化修饰。结果1.不同月龄小鼠脑内NEP表达以及氧化应激和神经炎症水平。C57小鼠15月龄以上组与5月龄和10月龄组相比,大脑皮层内NEP蛋白表达量明显减少（p＜0.05）;15月龄以上组与5月龄组相比,HDAC1蛋白表达量明显下降（p＜0.05）;小脑内NEP蛋白表达随月龄逐渐下降,但无统计学意义;HDAC1蛋白表达在各年龄组中无明显改变。在皮层中,15月龄以上组与5月龄组相比,NEP m RNA水平明显减少（p＜0.05）;在小脑中,NEP m RNA水平随年龄的增加而减少,但无统计学意义。在海马中,脂质过氧化产物MDA水平随年龄的增加而增加,但无统计学差异。在皮层中Arg-1 m RNA水平随年龄增加而下降,但无统计学意义;10月龄组与5月龄组相比,NOS2 m RNA水平明显增加（p＜0.05）;15月龄以上组与5月龄组相比,IL1-β水平明显增加（p＜0.05）。2.SH-SY5Y细胞模型中NEP和HDAC1的表达水平。氧化应激模型中,MPP+给药组与CTRL组相比,SH-SY5Y细胞的NEP蛋白表达下降明显（p＜0.05）,而HDAC1的蛋白表达与CTRL组相比增加,但无统计学意义;NEP m RNA水平,在药物处理8 h后,给药组与CTRL组比开始出现下降,处理12 h后,给药组与CTRL组相比,NEP m RNA水平明显下降（p＜0.05）,在药物处理24 h后,给药组与CTRL组相比,NEP m RNA水平仍然下降（p＜0.05）,趋势没有改变。神经炎症模型中,SH-SY5Y细胞单独给予LPS组与CTRL组相比,NEP蛋白表达无明显改变。在LPS活化小胶质细胞条件培养液处理组,与CTRL组相比,NEP蛋白表达明显减少（p＜0.05）,HDAC1蛋白表达在各组间无明显差异。3.SH-SY5Y细胞模型和不同月龄小鼠脑内NEP基因启动子区的组蛋白修饰水平。在SH-SY5Y氧化应激模型中,与CTRL组相比,MPP+6 h处理组NEP启动子区H3K4me2修饰水平明显降低（p＜0.05）,H3K9ac修饰水平增加,但是没有统计学差异,HDAC1结合量明显下降（p＜0.05）;24 h处理组H3K4me2和H3K9ac修饰水平变化趋势与6 h一致,但是差别较小,没有统计学意义,HDAC1修饰水平则与对照组没有差异。在神经炎症模型中,小胶质细胞条件培养液处理组与CTRL组相比,NEP启动子区H3K4me2修饰水平下降,但无统计学意义,H3K9ac修饰水平明显降低（p＜0.05）,HDAC1修饰水平增加,但无统计学意义。不同月龄C57小鼠中,NEP启动子区H3K9ac修饰水平随年龄增加而增加;10月龄与5月龄相比,HDAC1修饰水平明显增加,但15月龄与5月龄相比,略有增加;H3K4me2修饰水平随年龄略增加;10月龄与5月龄相比,H3K9me3修饰水平明显增加,但15月龄与5月龄相比,增加不明显。结论1.小鼠脑内NEP表达随年龄增加而下降,且在Aβ易沉积脑区下降明显;NEP转录水平随年龄增加而降低;促炎因子IL-1β表达和氧化应激水平随年龄增加而增加,抑制炎症因子Arg-1表达随年龄增加而减少。2.氧化应激和炎症因子可以引起NEP蛋白表达下降和转录水平的降低,且转录水平在较早时间即发生变化,变化趋势不随时间增长而改变。3.氧化应激和炎症因子可引起NEP启动子区表观遗传修饰发生改变。小鼠脑内表观遗传修饰改变随年龄增加而发生变化。