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目的:应激是机体在各种内外环境因素及社会、心理因素刺激时所出现的全身性非特异性适应反应。目前的研究提示过度的应激会造成机体心理、生理及代谢功能等多方面的改变。本研究是结合法医学实践中亟待解决的重要科学问题而设计的,法医学检案中时有遭受重大精神打击的当事人或被羁押的犯罪嫌疑人发生死亡的案例,在排除所有其他死因的前提下,有部分学者认为属应激性死亡,但目前尚缺少足够的基础研究依据。众所周知应激反应首先引起中枢神经系统的改变,黑质(substantia nigra,SN)和腹侧被盖区(ventral tegmental area,VTA)是中脑两个重要的多巴胺能神经核团,以往研究提示多巴胺能神经细胞可能在应激反应中发挥作用,但详细的作用机制尚不清楚,因此本研究旨在系统观察不同时程应激大鼠中脑黑质和腹侧被盖区多巴胺能神经细胞的病理性改变,探明多巴胺能神经细胞特异性标记物酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)及内质网应激相关蛋白的表达变化,为应激性损伤的机制研究提供病理形态学依据。方法:1本实验将60只SD(Sprague-Dawley)雄性大鼠,体重200±20g,随机分组,每组6只,分为1天、3天、7天、14天和21天组及各相应时间点的对照组。实验组采用束缚加冰水游泳应激模型(RS+IS应激模型),即给予大鼠每天6小时(8:00-14:00)仰卧位固定的束缚处理,同时禁食水,束缚完毕后,立即进行5分钟冰水游泳。在实验组处理期间,各对照组禁食水并自由活动于笼中,其余时间所有大鼠自由进食水,各实验组及相应对照组大鼠于实验结束第二天处死,取脑组织固定、脱水、透明、包埋及连续性切片,待做各种组织病理学染色使用。1)记录大鼠体重变化2)HE染色观察黑质和腹侧被盖区病理形态学改变3)硫堇特殊染色观察黑质和腹侧被盖区神经细胞尼氏体变化4)TH免疫组织化学染色计数黑质和腹侧被盖区多巴胺能神经细胞数目改变5)免疫荧光多重标记探讨黑质和腹侧被盖区多巴胺能神经细胞内质网应激相关蛋白GRP78(glucose-regulated protein 78),CHOP(C/EBP homologous protein)表达变化2阳性细胞计数及统计学分析:运用全景组织定量分析系统(MMTC)对两区域多巴胺能神经细胞(棕色)进行数量统计,目前此软件已经在国内、外得到广泛认可。统计分析:采用SPSS21.0统计软件进行统计分析,各组均数的比较行单因素方差分析(One-way ANOVA),用最小显著差法(Least Significant Difference,LSD)作两两比较,以P<0.05为有显著统计学差异。结果:1.大鼠体重变化结果对照组大鼠体重随时间的延长呈逐渐上升趋势。束缚加冰水游泳应激实验组除1天组的体重略有下降外,其余各实验组随时间的延长大鼠体重逐渐增加且各实验组与相应对照组相比,实验组大鼠体重增长速度明显降低。2.黑质和腹侧被盖区病理形态学改变对照组两区域组织结构清晰,细胞体积正常,胞核和胞质层次清晰;应激1天组、3天组、7天组和对照组相比,组织未见明显病理学改变;应激14天组、21天组部分神经细胞固缩,胞浆深染,嗜酸性染色明显增强。3.黑质和腹侧被盖区神经细胞尼氏体变化3.1黑质神经细胞尼氏体变化对照组黑质神经细胞结构清晰,尼氏体均匀分布于胞浆内。与对照组相比,应激1天组无明显变化,3天组部分神经细胞水肿,尼氏体结构不清,7天组、14天组部分细胞尼氏体消失,神经细胞胞浆固缩浓染,21天组尼氏体消失及胞浆浓染固缩的神经细胞数目增多。3.2腹侧被盖区神经细胞尼氏体变化对照组腹侧被盖区神经细胞胞浆丰富且分布均匀。与对照组相比,应激1天、3天组部分区域神经细胞出现水肿,胞浆染色加深,应激7天组、14天组部分神经细胞胞浆固缩浓染,尼氏体结构不清。21天组胞浆浓染固缩,尼氏体消失的神经细胞数目增多。4.黑质和腹侧被盖区多巴胺能神经细胞数目变化4.1黑质多巴胺能神经细胞数目变化在显微镜下用MMTC计数分析系统计数,结果:与对照组相比,应激1天组多巴胺能神经细胞数目未见明显改变,应激3天组、7天组、14天组和21天组,多巴胺能神经细胞数目随应激时间的延长呈逐渐减少趋势。4.2腹侧被盖区多巴胺能神经细胞数目变化在显微镜下用MMTC计数分析系统计数,结果:与对照组多巴胺能神经细胞数目相比,应激1天组未见明显差异,3天组、7天组、14天组和21天组,随着应激时间的延长,多巴胺能神经细胞数目明显减少。5.黑质和腹侧被盖区多巴胺能神经细胞TH~+-GRP78~+、TH~+-CHOP~+共表达变化5.1黑质和腹侧被盖区多巴胺能神经细胞TH~+-GRP78~+共表达变化黑质:与对照组相比,应激1天组,3天组TH~+-GRP78~+共表达阳性细胞数目迅速增多并到达高峰,随着应激时程的延长,TH~+-GRP78~+共表达阳性细胞数目在应激7天组、14天组和21天组明显减少。腹侧被盖区:和对照组相比,TH~+-GRP78~+共表达阳性细胞在应激1天组,3天组急剧升高,并在3天组到达峰值,随着应激时间的延长,7天组、14天组和21天组共表达阳性细胞数目显著减少。5.2黑质和腹侧被盖区多巴胺能神经细胞TH~+-CHOP~+共表达变化黑质:与对照组相比,TH~+-CHOP~+共表达阳性细胞在应激1天组,3天组,7天组,14天组逐渐升高,尽管应激21天组共表达阳性细胞数目减少,但仍明显高于对照组。腹侧被盖区:与对照组相比,TH~+-CHOP~+共表达阳性细胞在应激1天组,3天组,7天组,14天组逐渐上升并到达高峰,虽然应激21天组共表达阳性细胞数目减少,但仍明显高于对照组。6.多巴胺神经细胞数量与TH~+-CHOP~+共表达细胞数量相关分析。两区域多巴胺神经细胞数量与TH~+-CHOP~+共表达细胞数量的变化呈明显的负相关关系。结论:本研究成功建立了不同时程束缚加冰水游泳应激大鼠模型,采用HE染色、硫堇染色、免疫组织化学染色和免疫荧光多重标记进行了系统研究。研究结果表明较长时程的应激可以导致黑质和腹侧被盖区多巴胺能神经细胞的损伤及数目的减少,内质网应激相关蛋白GRP78、CHOP的表达呈现了动态变化,提示内质网应激可能参与了中脑多巴胺能神经细胞的病理性改变。