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目的:为了更深入的研究DAZ基因与扩展莫尼茨绦虫生殖发育的关系,定位DAZ蛋白的表达位点以及分布特点,并以扩展莫尼茨绦虫作为模式生物研究高等生物甚至人类的生育器官的发育奠定基础,从分子水平掌握扩展莫尼茨绦虫的生长特点,通过对DAZ基因表达产物功能及分布规律的研究,将其作为靶分子研制核酸疫苗或者寻找它们的抑制物来研发新药,通过控制该基因,减少或者阻止精子的生成,从而减少虫卵的产生,使其不能排除有效虫卵,对莫尼茨绦虫病的预防与控制都具有重要意义。 方法:采用苏木素染色法对绦虫虫体进行染色、分离、鉴定出扩展莫尼茨绦虫。用TrizolReagent提取总RNA,以逆转录酶PowerScript合成第一链cDNA,参照GenBank中登录的扩展莫尼茨绦虫DAZ基因序列设计特异性引物,通过PCR技术合成并扩增DAZ基因的保守结构域序列,将扩增产物克隆到pMD19-T载体中进行序列测定,测序正确的序列用限制性内切酶XhoⅠ和SalⅠ进行双酶切,构建重组质粒pET28a-DAZ,转入BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达。表达产物经纯化后用SDS-PAGE及Westernblot分析表达产物。将纯化后的产物免疫小鼠,免疫程序采用四次免疫,每十天一次,最后用眼球采血的方法收集血清。根据制备石蜡切片的步骤和方法制备扩展莫尼茨绦虫的石蜡切片,用收集的血清作为免疫组化的一抗进行DAZ蛋白的组织定位。 结果:以扩展莫尼茨绦虫DAZ基因阳性质粒为模板,用合成的引物进行PCR扩增,成功扩增出大小约405bp的片段。扩增产物经回收纯化,连接到pMD19-TVector上,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,获得含有DAZ基因ORF片段的克隆质粒,PCR和双酶切鉴定结果均显示重组克隆质粒pMD19T-DAZ构建正确,测序结果证实目的片段序列插入正确。构建的阳性重组表达载体pET28a-DAZ转入表达宿主BL21(DE3)中,经XholⅠ和SalⅠ双酶切鉴定,获得5369bp(pET-28a载体)与405bp的目的条带,表明DAZ基因ORF重组表达质粒构建成功。重组质粒pET28a-DAZ转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导后SDS-PAGE分析结果表明,在约14kd处出现与预计大小一致的条带,证明重组蛋白表达成功。扩展莫尼茨绦虫全虫蛋白经SDS-PAGE电泳后,转移至PVDF膜上,分别用重组蛋白免疫小鼠制备的高免血清和非免疫小鼠血清(阴性对照)进行免疫学反应,结果显示,扩展莫尼茨绦虫天然DAZ蛋白能被重组DAZ蛋白制备的阳性血清识别,在约14kd处出现显色带,证明该蛋白具有良好的抗原性。扩展莫尼茨绦虫石蜡切片的免疫组化结果清晰,准确定位出DAZ蛋白主要分布在扩展模拟次绦虫的成节和孕节内,在幼节没有发现分布。 结论:本试验以扁形动物门绦虫纲的扩展莫尼茨绦虫为研究对象,克隆并成功表达出无精子综合症相关蛋白。通过对表达产物的可溶性分析,发现该融合蛋白易和细胞的其它成分分离,有利于蛋白表达量的提高,且可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解作用。免疫组化结果表明DAZ蛋白主要分布在雌性生殖器官(卵巢、卵黄腺、受精囊)和雄性生殖器官(睾丸、储精囊)中,为今后深入研究无精子综合症相关基因在虫体生长过程的作用机理提供重要的理论依据,为将无精子综合症相关基因作为药物靶标和疫苗候选基因提供依据,以期对绦虫病的防控做出贡献。