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背景：盐诱导激酶1(salt inducible kinase 1, SIK1)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，它主要在肝、肾及心脏等组织中表达，近年研究发现SIK1可以调节肝脏糖异生和肝脏脂质合成，在糖脂代谢中起关键作用。我们前期研究发现，在2型糖尿病非酒精性脂肪肝病大鼠的肝脏中，SIK1的表达降低，固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)的表达增加，而复方贞清方可以上调SIK1的表达，降低血糖和血脂；在高糖培养的HepG2细胞中，SIK1的表达和活性降低，过表达SIK1能降低SREBP-1c及其下游生脂基因脂肪酸合成酶(FAS)和乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的表达。以上研究结果提示SIK1的表达和(或)功能下调可能是多因素诱导的NAFLD以及全身糖脂代谢紊乱发生发展的关键环节，但其功能还需进一步证实。目的：本研究首先通过建立2型糖尿病大鼠非酒精性脂肪肝模型大鼠，观察SIK1在肝脏中的表达变化，明确SIK1和2型糖尿病非酒精性脂肪肝之间的关系；构建携带大鼠SIK1基因的重组腺病毒表达载体，通过特异性上调和下调肝细胞中SIK1的表达，观察其对2型糖尿病非酒精性脂肪肝表型的影响，从整体动物和分子水平，探讨SIK1基因在2型糖尿病非酒精性脂肪肝疾病发生和进展过程中的作用及贞清方的干预机制，并为中药复方改善2型糖尿病非酒精性脂肪肝提供新的药理机制。
方法：
1.载体构建：
大鼠SIK1重组腺病毒(recombinant adenovirus expressing SIK1，Ad-SIK1)、携带绿色荧光蛋白的重组腺病毒(recombinant adenovirus expressing green fluorescent protein，Ad-GFP)以及携带有SIK1siRNA干扰序列(AD-siSIK1)和阴性对照siRNA干扰序列(AD-siCtrl)的重组腺病毒均由上海吉凯基因化学技术有限公司构建。
2.特异性上调肝细胞SIK1对2型糖尿病大鼠非酒精性脂肪性肝发生发展的作用及贞清方干预：
应用高糖高脂饮食结合小剂量链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型，将成模大鼠随机分为模型组、贞清方组、二甲双胍组、Ad-SIK1组和Ad-GFP组，每组8只，并设立正常对照组8只，贞清方组给予其提取液3.78g/kg/d灌胃，二甲双胍组给予二甲双胍混悬液150mg/kg/d灌胃，正常对照组和模型组给予同体积的双蒸水灌胃，Ad-SIK1组通过尾静脉注射给予0.05mlAd-SIK1(1×1011plaqueformingunits/ml)，Ad-GFP组过尾静脉注射给予0.05mlAd-GFP(1×1011plaqueformingunits/ml)。腺病毒治疗组持续治疗8周，灌胃治疗组持续治疗12周。检测各组大鼠空腹血糖(FBG)、血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、血清丙氨酸转移酶(ALT)及天冬氨酸转移酶(AST)血清胰岛素水平(FINS);称体重和肝脏湿重并计算肝重指数，HE染色和免疫组织化学法观察大鼠肝脏病理变化及SIK1、环磷酸腺苷调节转录共激活因子2(CRTC2)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)、pT182SIK1、pS171CRTC2、pS577SIK1、SREBP-1c、FAS和ACC在肝脏的表达，RT-PCR和Westernblot检测各组大鼠肝脏组织SIK1、CRTC2、PEPCK、G6Pase、SREBP-1c、FAS和ACCmRNA和蛋白及pT182SIK1、pS171CRTC2、pS577SIK1的表达。
3.特异性下调肝细胞SIK1对2型糖尿病大鼠非酒精性脂肪性肝发生发展的作用及贞清方干预：
30只雄性Wistrar大鼠普通饲料适应性喂养1周后，取5只大鼠作为正常对照组，喂以常规饲料，其余用于建立2型糖尿病非酒精性脂肪肝模型，给予高脂饲料(45kcal%)喂养4周后，给予STZ(32mg/kg)1次性腹腔注射[24]，成模大鼠随机分为五组：糖尿病模型组(DM)、模型阴性干扰对照组(siCtrl)、模型SIK1敲低组(siSIK1)和模型SIK1敲低+贞清方组(siSIK1+ZQR)，继续予以高脂饲料喂养，为2型糖尿病NAFLD模型。siCtrl组通过尾静脉注射给予0.05mlAd-SIK1-RNAi-negativecontrol(1×1011plaqueformingunits/ml)，siSIK1组通过尾静脉注射给予0.05mlAd-SIK1-RNAi(1×1011plaqueformingunits/ml)，siSIK1+ZQR组通过尾静脉注射给予0.05mlAd-SIK1-RNAi(1×1011plaqueformingunits/ml)，同时给予贞清方提取液3.26g/kg/d灌胃，腺病毒治疗每周注射1次，持续治疗8周，灌胃治疗持续8周。检测各组大鼠空腹血糖(FBG)、血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、血清丙氨酸转移酶(ALT)及天冬氨酸转移酶(AST);称体重，HE染色和免疫组织化学法观察大鼠肝脏病理变化及SIK1、环磷酸腺苷调节转录共激活因子2(CRTC2)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)、pT182SIK1、pS171CRTC2、pS577SIK1、SREBP-1c、FAS和ACC在肝脏的表达，RT-qPCR和Westernblot检测各组大鼠肝脏组织SIK1、CRTC2、PEPCK、G6Pase、SREBP-1c、FAS和ACCmRNA和蛋白及pT182SIK1、pS171CRTC2、pS577SIK1的表达。
结果：
1、特异性上调肝细胞SIK1对2型糖尿病大鼠非酒精性脂肪性肝发生发展的作用及贞清方干预
和正常对照组相比，糖尿病模型组大鼠FBG、TG、TC和肝重指数均显著升高，肝脏重度脂肪变性，肝脏SIK1mRNA和蛋白的表达明显减少，pT182SIK1、pS171CRTC2磷酸化水平显著降低，pS577SIK1磷酸化水平显著升高，CRTC2、PEPCK、G6Pase、SREBP-1c、FAS和ACCmRNA和蛋白的表达明显增加；
和糖尿病模型组相比，Ad-SIK1组大鼠FBG和TC降低，TG显著降低，肝脏SIK1mRNA和蛋白的表达、pT182SIK1、pS171CRTC2磷酸化水平均明显上调，而pS577SIK1磷酸化水平显著降低，CRTC2、PEPCK、G6Pase、SREBP-1c、FAS和ACCmRNA和蛋白的表达显著下调；
和糖尿病模型组相比，贞清方组大鼠的FBG、TG、TC和肝重指数均降低，肝脏SIK1mRNA和蛋白的表达均显著升高，pT182SIK1、pS171CRTC2磷酸化水平显著增加，pS577SIK1磷酸化水平显著降低，CRTC2、PEPCK、G6Pase、SREBP-1c、FAS和ACC的mRNA和蛋白的表达均显著降低，同时大鼠的肝脏病变程度得到了改善；贞清方组和二甲双胍组的胰岛素分泌显著增加。
2、特异性下调肝细胞SIK1对2型糖尿病大鼠非酒精性脂肪性肝发生发展的作用及贞清方干预
和糖尿病模型组相比，siSIK1组大鼠FBG和TC升高，TG显著升高，肝脏SIK1mRNA和蛋白的表达、pT182SIK1、pS171CRTC2磷酸化水平均明显下调，而pS577SIK1磷酸化水平显著升高，CRTC2、PEPCK、G6Pase、SREBP-1c、FAS和ACCmRNA和蛋白的表达显著升高；
和糖尿病模型组相比，siSIK1+ZQR组大鼠的FBG、TG和TC均显著降低，肝脏SIK1mRNA和蛋白的表达均显著升高，pT182SIK1、pS171CRTC2磷酸化水平显著增加，pS577SIK1磷酸化水平显著降低，CRTC2、PEPCK、G6Pase、SREBP-1c、FAS和ACC的mRNA和蛋白的表达均显著降低，同时大鼠的肝脏病变程度得到了改善。
结论：
1、本研究通过高脂饮食喂养结合STZ诱导，成功建立了2型糖尿病非酒精性脂肪肝模型，并且发现该模型肝脏的SIK1表达降低。
2、重组腺病毒介导的SIK1过表达可减轻2型糖尿病大鼠非酒精性脂肪肝病变，缓解2型糖尿病大鼠的糖脂代谢。
3、重组腺病毒介导的SIK1敲低可促进肝脏糖异生以及肝内脂质生成增加诱导非酒精性脂肪肝的发生发展。
4、贞清方可上调2型糖尿病非酒精性脂肪肝大鼠肝脏及SIK1敲低糖尿病大鼠肝脏SIK1的表达，从而改善2型糖尿病大鼠非酒精性脂肪肝病变。
方法：
1.载体构建：
大鼠SIK1重组腺病毒(recombinant adenovirus expressing SIK1，Ad-SIK1)、携带绿色荧光蛋白的重组腺病毒(recombinant adenovirus expressing green fluorescent protein，Ad-GFP)以及携带有SIK1siRNA干扰序列(AD-siSIK1)和阴性对照siRNA干扰序列(AD-siCtrl)的重组腺病毒均由上海吉凯基因化学技术有限公司构建。
2.特异性上调肝细胞SIK1对2型糖尿病大鼠非酒精性脂肪性肝发生发展的作用及贞清方干预：
应用高糖高脂饮食结合小剂量链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型，将成模大鼠随机分为模型组、贞清方组、二甲双胍组、Ad-SIK1组和Ad-GFP组，每组8只，并设立正常对照组8只，贞清方组给予其提取液3.78g/kg/d灌胃，二甲双胍组给予二甲双胍混悬液150mg/kg/d灌胃，正常对照组和模型组给予同体积的双蒸水灌胃，Ad-SIK1组通过尾静脉注射给予0.05mlAd-SIK1(1×1011plaqueformingunits/ml)，Ad-GFP组过尾静脉注射给予0.05mlAd-GFP(1×1011plaqueformingunits/ml)。腺病毒治疗组持续治疗8周，灌胃治疗组持续治疗12周。检测各组大鼠空腹血糖(FBG)、血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、血清丙氨酸转移酶(ALT)及天冬氨酸转移酶(AST)血清胰岛素水平(FINS);称体重和肝脏湿重并计算肝重指数，HE染色和免疫组织化学法观察大鼠肝脏病理变化及SIK1、环磷酸腺苷调节转录共激活因子2(CRTC2)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)、pT182SIK1、pS171CRTC2、pS577SIK1、SREBP-1c、FAS和ACC在肝脏的表达，RT-PCR和Westernblot检测各组大鼠肝脏组织SIK1、CRTC2、PEPCK、G6Pase、SREBP-1c、FAS和ACCmRNA和蛋白及pT182SIK1、pS171CRTC2、pS577SIK1的表达。
3.特异性下调肝细胞SIK1对2型糖尿病大鼠非酒精性脂肪性肝发生发展的作用及贞清方干预：
30只雄性Wistrar大鼠普通饲料适应性喂养1周后，取5只大鼠作为正常对照组，喂以常规饲料，其余用于建立2型糖尿病非酒精性脂肪肝模型，给予高脂饲料(45kcal%)喂养4周后，给予STZ(32mg/kg)1次性腹腔注射[24]，成模大鼠随机分为五组：糖尿病模型组(DM)、模型阴性干扰对照组(siCtrl)、模型SIK1敲低组(siSIK1)和模型SIK1敲低+贞清方组(siSIK1+ZQR)，继续予以高脂饲料喂养，为2型糖尿病NAFLD模型。siCtrl组通过尾静脉注射给予0.05mlAd-SIK1-RNAi-negativecontrol(1×1011plaqueformingunits/ml)，siSIK1组通过尾静脉注射给予0.05mlAd-SIK1-RNAi(1×1011plaqueformingunits/ml)，siSIK1+ZQR组通过尾静脉注射给予0.05mlAd-SIK1-RNAi(1×1011plaqueformingunits/ml)，同时给予贞清方提取液3.26g/kg/d灌胃，腺病毒治疗每周注射1次，持续治疗8周，灌胃治疗持续8周。检测各组大鼠空腹血糖(FBG)、血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、血清丙氨酸转移酶(ALT)及天冬氨酸转移酶(AST);称体重，HE染色和免疫组织化学法观察大鼠肝脏病理变化及SIK1、环磷酸腺苷调节转录共激活因子2(CRTC2)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)、pT182SIK1、pS171CRTC2、pS577SIK1、SREBP-1c、FAS和ACC在肝脏的表达，RT-qPCR和Westernblot检测各组大鼠肝脏组织SIK1、CRTC2、PEPCK、G6Pase、SREBP-1c、FAS和ACCmRNA和蛋白及pT182SIK1、pS171CRTC2、pS577SIK1的表达。
结果：
1、特异性上调肝细胞SIK1对2型糖尿病大鼠非酒精性脂肪性肝发生发展的作用及贞清方干预
和正常对照组相比，糖尿病模型组大鼠FBG、TG、TC和肝重指数均显著升高，肝脏重度脂肪变性，肝脏SIK1mRNA和蛋白的表达明显减少，pT182SIK1、pS171CRTC2磷酸化水平显著降低，pS577SIK1磷酸化水平显著升高，CRTC2、PEPCK、G6Pase、SREBP-1c、FAS和ACCmRNA和蛋白的表达明显增加；
和糖尿病模型组相比，Ad-SIK1组大鼠FBG和TC降低，TG显著降低，肝脏SIK1mRNA和蛋白的表达、pT182SIK1、pS171CRTC2磷酸化水平均明显上调，而pS577SIK1磷酸化水平显著降低，CRTC2、PEPCK、G6Pase、SREBP-1c、FAS和ACCmRNA和蛋白的表达显著下调；
和糖尿病模型组相比，贞清方组大鼠的FBG、TG、TC和肝重指数均降低，肝脏SIK1mRNA和蛋白的表达均显著升高，pT182SIK1、pS171CRTC2磷酸化水平显著增加，pS577SIK1磷酸化水平显著降低，CRTC2、PEPCK、G6Pase、SREBP-1c、FAS和ACC的mRNA和蛋白的表达均显著降低，同时大鼠的肝脏病变程度得到了改善；贞清方组和二甲双胍组的胰岛素分泌显著增加。
2、特异性下调肝细胞SIK1对2型糖尿病大鼠非酒精性脂肪性肝发生发展的作用及贞清方干预
和糖尿病模型组相比，siSIK1组大鼠FBG和TC升高，TG显著升高，肝脏SIK1mRNA和蛋白的表达、pT182SIK1、pS171CRTC2磷酸化水平均明显下调，而pS577SIK1磷酸化水平显著升高，CRTC2、PEPCK、G6Pase、SREBP-1c、FAS和ACCmRNA和蛋白的表达显著升高；
和糖尿病模型组相比，siSIK1+ZQR组大鼠的FBG、TG和TC均显著降低，肝脏SIK1mRNA和蛋白的表达均显著升高，pT182SIK1、pS171CRTC2磷酸化水平显著增加，pS577SIK1磷酸化水平显著降低，CRTC2、PEPCK、G6Pase、SREBP-1c、FAS和ACC的mRNA和蛋白的表达均显著降低，同时大鼠的肝脏病变程度得到了改善。
结论：
1、本研究通过高脂饮食喂养结合STZ诱导，成功建立了2型糖尿病非酒精性脂肪肝模型，并且发现该模型肝脏的SIK1表达降低。
2、重组腺病毒介导的SIK1过表达可减轻2型糖尿病大鼠非酒精性脂肪肝病变，缓解2型糖尿病大鼠的糖脂代谢。
3、重组腺病毒介导的SIK1敲低可促进肝脏糖异生以及肝内脂质生成增加诱导非酒精性脂肪肝的发生发展。
4、贞清方可上调2型糖尿病非酒精性脂肪肝大鼠肝脏及SIK1敲低糖尿病大鼠肝脏SIK1的表达，从而改善2型糖尿病大鼠非酒精性脂肪肝病变。