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小肠上皮细胞是一种良好的细胞模型,广泛应用于小肠功能和病原微生物致病机理的研究。小肠上皮细胞缺乏端粒酶活性,大约在体外培养十代,细胞就进入衰老期,不能继续传代培养。人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因作为端粒酶催化亚基,能通过阻止端粒的缩短而延长细胞生命周期。研究证实,多种细胞已经应用hTERT基因成功转导。我们分离培养了猪小肠上皮细胞(SIECs),进行了小肠上皮细胞hTERT转染的研究,并且开展了猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)对上皮细胞活性影响的研究,获得了以下结果:(1)无菌采取猪小肠,组织块法分离培养上皮细胞。培养的上皮细胞为单层贴壁生长,呈铺路石样,具有较强的增殖能力。细胞角蛋白18鉴定为阳性,结合细胞形态学观察,表明,分离的细胞为小肠上皮细胞。细胞生长活力好,在体外连续培养10代后,细胞生长停滞,上皮样特征消失。(2)采用脂质体转染法,将编码pCI-neo-hTERT真核表达质粒导入原代培养的小肠上皮细胞。保持400μg/mL G418筛选,约15d后,得到抗G418阳性细胞群,转移至新皿,200μg/mL G418维持,扩大培养。RT-PCR检测到hTERT mRNA在转染细胞中的表达,说明外源性hTERT稳定转染入小肠上皮细胞。目前已传代培养10个月,传至80代。命名为转端粒酶猪小肠上皮细胞(hTERT-IECs)。(3)取转染后第60代hTERT-IECs,待生长至70%单层时接种猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)M12F2株,加维持液(含20 mL/L胎牛血清培养基)培养。同时设定阴性对照。检测接毒后24、48、72h的细胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性,同时检测盲传至第2代、5代细胞的细胞周期。结果表明,细胞形态未发生明显的变化,不引起明显的细胞病变。Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性降低,细胞周期发生变化,发生凋亡。综上所述,本研究在成功分离培养SIECs的基础上,将人的端粒酶逆转录酶基因导入其中,延长了SIECs在体外培养的寿命,转染后的SIECs已经传代至80代。猪传染性胃肠炎病毒不能使细胞产生明显的病变,但是降低了细胞的活性,为猪传染性胃肠炎病毒的致病机理提供科学资料。