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D-葡萄糖二酸是一种非常有前景的平台化合物,已被广泛用于食品、医药和化工等领域。相较于化学氧化法,D-葡萄糖二酸的生物合成法因具有高效、经济和环保等特点而逐渐受到国内外学者的关注。然而关于D-葡萄糖二酸生物合成法的相关研究至今相当有限。为此,本课题基于代谢工程对D-葡萄糖二酸生物合成进行研究,为其工业化应用提供理论依据。本论文主要研究内容和结果如下:第一,以D-葡萄糖醛酸为原料,经葡萄糖醛酸脱氢酶（Uronate dehydrogenate,Udh）一步催化合成D-葡萄糖二酸,即“一步法”合成D-葡萄糖二酸。首先,利用基因挖掘手段,从根癌农杆菌菌株（Agrobacterium tumefaciens（At）,AtLBA4404,AtGV3101,AtEHA105）挖掘到三个葡萄糖醛酸脱氢酶。其次,对三个酶的酶学性质分析,结果显示:三个葡萄糖醛酸脱氢酶最适反应温度为30℃,最适反应pH为8.0,催化效率分别为800 s-1mM-1（AtLBA440Udh）,600 s-1mM-1（AtGV3101Udh）,530 s-1mM-1（AtEHA105Udh）。接着采用半理性设计策略对AtLBA4404Udh进行点饱和突变和组合突变,以提高其热稳定性和催化活性。结果表明:AtLBA4404的UdhA39P/H99Y/H234K三重突变体在59℃时的半衰期延长近400倍。其T 5010值从58℃提高到63℃。与野生酶Udh相比,UdhA39P/H99Y/H234K酶活提高近2.5倍。在最优条件下,以D-葡萄糖醛酸为底物,用重组全细胞(E.coli BL21（DE3）/pET-udhA39P/H99Y/H234K-nox)为葡萄糖醛酸脱氢酶的载体,催化D-葡萄糖醛酸合成D-葡萄糖二酸,其产量为98 mmol/L,转化率高达98%。此方法具有产量和产率高等特点,但其原料成本较高,制约了其工业化应用。第二,为了解决上述原料成本高的问题,本课题基于系统代谢工程在大肠杆菌体内构建了一条转化D-葡萄糖为D-葡萄糖二酸的合成途径。主要通过重新定向碳代谢流、阻断副产物途径基因表达、引入NAD+原位再生系统和微调关键酶的活性等策略,构建了最佳工程菌株GA17。其次优化培养基种类和培养条件（温度、pH值、底物浓度和溶氧水平）实现了菌株GA17生产D-葡萄糖二酸的最佳性能。在最优条件下,以D-葡萄糖和甘油为底物,大肠杆菌菌株GA17通过发酵生产D-葡萄糖二酸,其产量为25.5 mmol/L,产率为46%。相较于“一步法”,虽然该方法以可再生生物基原料进行合成目标产物,但其产量、产率有待进一步提高。第三,为进一步实现D-葡萄糖二酸的低成本工业化应用,本课题基于蔗糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖变位酶、肌醇-1-磷酸合成酶、肌醇单磷酸酯酶、肌醇氧化酶、葡萄糖醛酸脱氢酶和NADH氧化酶七种酶构建了一条D-葡萄糖二酸的无细胞生物催化系统,即“一锅法”合成D-葡萄糖二酸。该系统实现了NADH-NAD+的循环利用因而无需额外添加ATP或NAD+。通过对该反应体系的温度、pH、NAD+、缓冲液、酶组成及分批添加肌醇加氧酶等条件进行优化,实现了此无细胞生物催化反应体系的最佳性能。在优化条件下,以蔗糖为原料,利用该无细胞生物催化系统生产D-葡萄糖二酸,其产量为34.8 mmol/L,产率为75%（蔗糖）。此方法相较于前两种方法,具有高效、经济和副产物少等特点,同时也是国内外首次利用无细胞生物催化系统来合成D-葡萄糖二酸,极大地推进了D-葡萄糖二酸的低成本工业化进程。总之,本课题基于代谢工程成功构建了三条D-葡萄糖二酸高效合成途径,不仅为D-葡萄糖二酸的生物合成提供新的方法,更为D-葡萄糖二酸的低成本工业化生产奠定了理论基础,同时也为其它高附加值化学品的生物合成途径提供可借鉴经验。