早粳稻空育131耐障碍性冷害基因OsPGR5的克隆

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低温、干旱、高盐等非生物胁迫是植物中最常见的危害植物生长和降低作物产量的环境因素。尤其是低温胁迫冷害,可以引起作物的大幅度减产,是目前世界范围内普遍存在的问题。随着抗逆性分子机制研究的日益深入,研究者发现在逆境胁迫条件下一些基因的表达量发生了明显的变化,对这些基因进行遗传转化可以直接提高植物的耐逆性,从而更加显著的改良作物抗逆性的效果。本实验以东北地区具有耐寒高产的特性的水稻品种空育131为材料,采用Solexa测序芯片,分析研究了孕穗水稻空育131在不同冷处理时间点的表达谱,来探索其响应低温逆境胁迫的分子调控机理。并从表达谱结果中筛选出了一个参与光合作用受低温胁迫表达量变化明显的基因—质子梯度蛋白5(PGR5)基因,通过Real time-PCR实验对冷胁迫不同时间OsPGR5基因进行表达分析,利用Gateway技术克隆该基因并进行了对水稻龙粳11的遗传转化,最终获得转基因植株。本研究在提高植物耐逆性方面具有重要的研究价值,为农作物抗冷基因工程的应用提供理论依据及基因资源。主要研究结果如下:1.孕穗期水稻空育131冷胁迫数字表达谱分析通过对数字基因表达谱分析,共发现7180个差异表达基因,其中四个处理时间点均上调的差异表达基因有225个。经pathway分析,在受到低温胁迫时,参与抵抗低温胁迫的主要代谢过程有与光合作用相关的,与糖代谢相关的,与调控相关的,与渗透调节相关等代谢途径。2. OsPGR5基因的表达分析利用全定量Real Time-PCR的方法对冷胁迫处理的水稻材料中目的基因的表达量变化进行检测,结果表明,OsPGR5基因在冷胁迫条件下瞬时表达,冷胁迫24小时以内耐冷水稻空育131OsPGR5基因高表达,龙粳11中OsPGR5基因表达无规律性,表达变化不明显,两种水稻抗冷性的差异很可能由于OsPGR5基因表达转录调控水平差异所导致。3. OsPGR5基因全长的克隆及序列分析以冷处理5h的水稻空育131cDNA为模板,通过PCR扩增,克隆了一个与冷胁迫相关的OsPGR5基因,该基因全长cDNA序列760bp,其中CDS区共378bp,编码125个氨基酸。4.植物表达载体的构建及遗传转化通过Gateway克隆技术将OsPGR5基因连接到植物表达载体pH7WG2上,采用农杆菌介导法对冷敏感水稻龙粳11愈伤组织进行遗传转化,转化率为8.4%,对T0代转基因水稻的纯合体进行分子生物学检测,进一步确定OsPGR5基因为植物逆境胁迫中重要的耐逆基因。
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