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贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis CC09）是一株兼具促植物生长和广谱抗病的高效内生菌和生防菌,对地黄连作障碍等土传病害以及小麦、葡萄和草莓等白粉病有很高的预防和治疗效果。其中,由非核糖体肽合成酶催化合成的环脂肽iturinA是介导该菌诱导系统抗性和抗病作用的关键活性物质。虽然iturinA合成酶的生化性质及编码基因簇的操纵子结构已比较清楚,但目前尚无该酶转录和/或转录后调控机制的系统性研究。本文以具有生防作用的贝莱斯芽孢杆菌CC09菌株为研究对象,采用基因组学、比较转录组学、RNA聚合酶突变、分子生物学和生物信息学等方法,综合研究贝莱斯芽孢杆菌CC09菌株的生物学特性和生防基础,并揭示该菌通过非核糖体代谢途径合成iturin A的调控机理,为研究有益芽孢杆菌的生防机理提供新的研究思路和途径。Hiseq2000全基因组测序结果表明,贝莱斯芽孢杆菌CC09菌株的基因组大小为4 167 153 bp;GC含量为46.1%;蛋白序列编码（CDS）4 141个,占基因总数的97.9%。约有677个基因直接或间接参与了 CC09菌株的生防作用,占总CDS的16.3%,其中,567个基因（占生防作用基因的83.8%）参与了 13个次级代谢产物的合成,包括4个新的次级代谢产物以及2个贝莱斯芽孢杆菌独有的次级代谢产物;53个基因与该菌的运动性和趋化性有关;14个基因参与了多糖的降解;36个基因与该菌的生物膜形成有关;7个基因参与了促植物生长激素类物质的合成。此外,在CC09菌株基因组中,还发现了一个139.512kb的基因组岛（Genome Islands）,编码与药物转运和毒素合成相关的酶。基于核心基因组序列的系统进化分析结果表明,CC09菌株与贝莱斯芽孢杆菌FZB42和Bacillus sp.Pc3亲缘关系最近,序列一致度（Identity）高达99%,而与解淀粉芽孢杆菌的亲缘关系相对较远,且解淀粉芽孢杆菌中的许多菌株可能为贝莱斯芽孢杆菌,其分类地位值得探讨。Iturin A为贝莱斯芽孢杆菌CC09菌株通过非核糖体代谢途径合成的主要抗菌物质之一。全基因组序列显示,该菌编码合成iturinA的非核糖体肽合成酶基因簇大小为37 249 bp,包含4个结构基因,依次为ituD、ituA、ituB和ituC,1个σA识别启动子。在启动子序列-35区上游64bp和137bp处还存在2个转录调控因子DegU结合位点。利用Red/ET重组系统,从CC09菌株中成功克隆了非核糖体肽合成酶基因簇,并实现了该基因簇在大肠杆菌中的表达,iturin A的产量为 47 μg/mL。以贝莱斯芽孢杆菌CC09菌株为受体菌,采用同源重组技术,构建了 8个遗传背景一致但RNA聚合酶β亚基发生H485Y、H485C、H485R、H485D、S490L、Q472R、S490L/S617F 和 S617F 突变的菌株,依次为 CC09-RIF1、CC09-RIF2、CC09-RIF3、CC09-RIF4、CC09-RIF5、CC09-RIF6、CC09-RIF7 和 CC09-617F 菌株。除CC09-617F菌株（S617F）对利福平敏感外,其它菌株均为抗利福平突变菌株。代谢产物的HPLC检测结果显示,CC09-RIF3（H485R）和CC09-RIF4（H485D）为iturinA合成正突变菌株,产iturinA的量分别为野生型菌株CC09的 1.67 倍和 2.03 倍;CC09-RIF1（H485Y）、CC09-RIF5（S490L）、CC09-RIF6（Q472R）和 CC09-RIF7（S490L/S617F）为 iturinA 合成负突变菌株,产 iturin A 的量分别为野生型菌株CC09 的 0.81、0.44、0.56和0.80倍;CCC09-RIF2（H485C）为iturinA合成中性突变株,产iturinA的量与野生型菌株无显著差异。另外,不同的抗利福平突变菌株拥有不同的生物学表型,其中,编码RNA聚合酶β亚基的H485突变显著影响贝莱斯芽孢杆菌对利福平的耐受性、群集运动能力以及抑菌活性等,显示H485对维持贝莱斯芽孢杆菌的正常生长和代谢具有重要作用。采用RNA-seq技术,比较了产iturinA正突变菌株CC09-RIF3（H485R）和负突变菌株CC09-RIF6（Q472R）与野生型菌株CC09在对数生长期的转录组差异,发现正、负突变菌株的差异表达基因（DEGs）约占总基因的1/4,其中,在正突变菌株中,上调的DEGs主要包括:运动性与趋化性相关基因;核糖体结构蛋白编码基因;糖（嘧啶代谢、果糖和甘露糖）代谢相关基因;以及细胞膜和细胞壁组分合成相关基因;而在负突变菌株中,无机离子转运系统、核糖体结构蛋白编码基因、细胞分裂与分化相关基因以及嘌呤代谢和脂肪酸代谢相关基因的表达均显著下调。另外,有8个DEGs富集到非核糖体代谢途径,除2个DEGs在正突变菌株中上调外,这些DEGs在正、负突变菌株中均下调;3个DEGs富集到I型聚酮合成途径,在正、负突变菌株中均显著下调。此外,利用Biolog GIII鉴定平板及激光共聚焦显微镜观察技术,研究了 H485R和Q472R突变对贝莱斯芽孢杆菌生理生化及形态的影响,分析了 DEGs与表型之间的关系,证明RNA聚合酶β亚基的H485R与Q472R突变全局性调控贝莱斯芽孢杆菌的生物学、生理学和代谢特性。基于产iturin A正突变菌株CC09-RIF3（H485R）和负突变菌株CC09-RIF6（Q472R）对数生长期的转录组数据,采用R语言的加权基因共表达网络（WGCNA）分析方法,将3 593个表达基因分成8个功能模块,并研究了“模块”与“表型”之间的关联性;鉴定了与iturinA非核糖体肽合成酶基因簇共表达的关键基因,包括:SB2400605、SB2410655、SB2413140、SB2413145、SB2413150、SB2413155、SB2413160等糖代谢相关基因以及phrF、phrA、rapA、rapB和degU等转录调控子编码基因;此外,还发现了 20个基因可能参与了 iturin A合成的转录后调控。基于上述研究结果,提出了贝莱斯芽孢杆菌合成iturin A的调控机理。