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目的: 通过研究华支睾吸虫成虫虫体抗原(CA)体外致敏的树突状细胞(DCs)分泌IL-12p70、刺激初始性T 细胞增殖及诱导T 细胞分泌IFN-γ和IL-4 的能力,探讨在华支睾吸虫感染小鼠后CA 对DCs 免疫活性的影响及进而诱导免疫应答的类型。
方法:
(1)成虫虫体抗原的制备:从感染华支睾吸虫的麦穗鱼中获取囊蚴,感染豚鼠,饲养50d 后,无菌取成虫,经匀浆,反复冻融,冷浸,超声破碎,再冷浸后低温超速离心,收集上清即为CA。
(2)DCs 的制备及鉴定:用rmGM-CSF 诱导分化BABL/c 小鼠骨髓细胞获得DCs,通过观察细胞形态、细胞表面分子及刺激T 细胞增殖进行DCs 的鉴定。
(3)收集DCs,分组加相应致敏原, DC-LPS 组:LPS 1μg/ml;DC-RPMI 组:等量的RPMI-164 培养基;DC-CA 组:80μg/ml CA,置37℃,5%CO2 孵箱培养24h,收集上清测IL-12p70。
(4)同种异体混合淋巴细胞反应(AMLR):各组DCs 用丝裂霉素c 灭活后和同种异体淋巴细胞按一定比例混合共培养3d,收集上清测IFN-γ和IL-4,用CCK-8 试剂盒检测T 细胞增殖情况。
(5)ELISA 检测细胞因子IL-12p70、IFN-γ和IL-4。
结果:
(1) 不同阶段DCs 分化程度和形态各异,培养7d 后,细胞表面可见明显的树突状突起。mDCs 表面有大量毛刺样突起,呈悬浮状态。透射电镜下可见典型的DCs 的形态特征。
(2) 培养的细胞表面表达较高MHC II 和CD86 分子,经LPS致敏后表达显著上调。
(3) DCs 分泌IL-12p70 的量:DC-CA 组分泌IL-12p70 量明显高于DC-RPMI 组,而低于DC-LPS 组。
(4) DCs 诱导T 细胞增殖情况:同种异体混合淋巴细胞反应,DC-CA 组对T 淋巴细胞的刺激指数高于DC-RPMI 组,而低于DC-LPS 组。DC-CA 组和DC-LPS 组分别与DC-RPMI 组进行两两比较,差别有统计学意义。
(5)DCs 和T 淋巴细胞共培养上清中IFN-γ的量:DC:T 为1:5和1:10 时,混合淋巴细胞共培养上清中,DC-CA组IFN-γ的水平明显高于DC-RPMI组,而低于DC-LPS 组;DC:T 为1:20 时各组差异无统计学意义。
(6)DCs 和T淋巴细胞共培养上清中IL-4 的量:混合淋巴细胞共培养,各组培养上清中IL-4 的水平均非常低,差别无显著性。
结论:
(1)CA 的刺激能促进BALB/c 小鼠骨髓来源的DCs 分泌IL-12。
(2)CA致敏的DCs 具有启动免疫应答的能力。
(3)CA 致敏的DCs 能诱导Th0 细胞向Th1 方向极化,CA 致敏DCs 诱导的免疫反应与华支睾吸虫感染早期的保护性免疫有密切相关。