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乙酰辅酶A是微生物合成,如脂肪酸合成、有机酸合成、萜类化合物合成等的重要前体物质。解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)因其能提供更高通量的乙酰辅酶A而被广泛应用于这些化合物的合成。进一步提高其乙酰辅酶A供应量,将有利于提高以此为前体物质的高附加值精细化学品的产量。因此,本文通过构建磷酸转酮酶途径以提高解脂耶氏酵母的乙酰辅酶A供应量,并将其应用于β-紫罗兰酮的生物合成研究中。具体地,本文通过对源于肠膜明串珠菌、两歧双歧杆菌的磷酸转酮酶,和克氏梭菌、枯草芽孢杆菌的磷酸转乙酰酶进行两两组合,即:LmPK-BsPTA,LmPK-CkPTA,BbPK-BsPTA,BbPK-CkPTA。利用Gibson组装快速构建含有磷酸转酮酶途径表达盒基因片段的质粒,采用CRISPR-Cas9基因编辑技术将表达盒基因片段整合至解脂耶氏酵母rDNA位点上获得4种组合的重组菌。通过酶活检测验证4种重组菌的磷酸转酮酶和磷酸转乙酰酶都成功活性表达。其中,BbPK酶活高于LmPK酶活,CkPTA与BsPTA酶活相近。利用RT-qPCR在转录水平的检测结果与酶活检测结果一致。摇瓶发酵中,4种重组菌的乙酸盐产量是起始菌株的1.6-2.2倍,且含BbPK酶的两个组合更优。考察四个组合磷酸转酮酶途径对β-紫罗兰酮合成的影响,整合BbPK-BsPTA的YLBI3109菌株的β-紫罗兰酮产量最高,达246.4 mg/L,是整合BbPK-CkPTA的YLBI3108菌株的1.9倍,是起始菌株YLBI3001的3.8倍。选择rDNA、pox4、D17、Leu2四个位点,考察磷酸转酮酶途径(BbPK-BsPTA组合)在基因组不同整合位点上对β-紫罗兰酮产量的影响,显示整合在Leu2位点的菌株YLBI3111产量最高,为268.4 mg/L,然而t-检验发现没有显著差异。考察磷酸转酮酶途径的拷贝数对β-紫罗兰酮产量的影响,构建xpr2-pox4,rDNA-pox4,rDNA-xpr2双拷贝菌株,以及rDNA-xpr2-pox4三拷贝菌株,发现随着拷贝数的增加,β-紫罗兰酮产量降低,而乙酸盐的产量增加,表明引入一个拷贝的磷酸转酮酶途径已经为β-紫罗兰酮的合成提供足量的乙酰辅酶A。在摇瓶水平上,对YLBI3111菌株的发酵条件进行碳源和氮源的优化,结果表明葡萄糖为最优碳源,当其浓度为60 g/L时,β-紫罗兰酮产量最高达到335.8 mg/L。胰蛋白胨优于尿素和硫酸铵,其发酵批次的β-紫罗兰酮产量分别是后两者的3.7和4.1倍。在3 L发酵罐水平上,采用20%溶解氧,20 ~oC和pH 6.0的条件,β-紫罗兰酮产量为369.5 mg/L。