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背景和目的:多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)是一种以骨髓中浆细胞的恶性增生为主要的病理学特征的血液系统常见的恶性肿瘤,疾病过程中最为明显的临床病变就是骨骼损害,表现为广泛性的溶骨性病变与不明原因的病理性骨折。而破骨细胞作为骨髓微环境的主角之一,由于骨髓瘤细胞的大量增殖与骨髓微环境的相互作用使其被异常激活,从而引发一系列骨骼损害相关的症状发生。本研究基于基因芯片技术筛选出与多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)病人生存率与预后相关的基因,从中选择一个重要的候选癌基因氨基酰tRNA合成酶相互作用多功能蛋白质1(Aminoacy-tRNA synthetase-interacting multi-functional protein 1,AIMP1)作为分析与研究对象;在体外研究AIMP1基因表达对多发性骨髓瘤细胞增殖与破骨细胞分化的关系的影响;探究AIMP1引起多发性骨髓瘤细胞增殖与破骨分化的机制;寻找一种中药以抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖。方法:1.首先采集了大量初诊及大剂量化疗后的MM患者骨髓样本,Affymetrix U133 Plus2.0用作基因芯片分析以获取全基因组表达谱,从中筛选出一个候选癌基因,分析其表达与MM病人生存率与预后的关系,并使用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测正常人与MM患者血清中的AIMP1表达量。2.使用靶向AIMP1的cDNA或shRNA病毒液感染骨髓瘤野生型细胞H929与OCI,并使用嘌呤霉素(puromycin)筛选出稳定过表达或敲低的细胞株,通过蛋白免疫印迹法(western blot,WB)验证稳转细胞株中AIMP1的表达情况,MTT比色法用于检测转染细胞与对照组细胞增殖情况。3.将重组质粒pET32a-AIMP1转化至大肠杆菌BL21进行扩增,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,使用镍柱获取纯化目的蛋白AIMP1。4.使用鼠源AIMP1过表达质粒,瞬时转染至鼠源巨噬细胞Raw264.7,通过蛋白免疫印迹法(western blot,WB)验证瞬转后细胞中AIMP1的表达情况,采用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法鉴定瞬转后破骨细胞的分化情况,WB检测影响破骨细胞分化的调控蛋白NFATcl的表达情况;使用不同浓度纯化蛋白AIMP1诱导鼠源巨噬细胞Raw264.7分化为破骨细胞,采用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法鉴定诱导后破骨细胞的分化情况,WB检测影响破骨细胞分化的调控蛋白NFATcl的表达情况。5.Homo_sapiens Long non-coding RNA数据测序分析技术服务,对样本Total RNA检测、去除rRNA、构建链特异性文库后,使用Illumina X Ten/NovaTM平台进行Pair-End测序,共采集89.87 Gb Raw Data,通过数据质控程序对原始数据(Raw data)进行处理,获得Clean Data进行后续数据分析。6.MTT比色法用于检测不同浓度纯化蛋白AIMP1对MM野生型细胞ARP1、CAG、H929和OCI体外增殖速度的影响,WB检测不同浓度纯化蛋白AIMP1对MM野生型细胞H929与OCI中MAPK通路相关蛋白表达的影响;构建小鼠异种移植瘤模型,并给予纯化蛋白AIMP1干预,使用游标卡尺定期测量肿瘤直径,待肿瘤直径达到20 mm时处死小鼠,剥离肿瘤,称重,拍照后冷冻保存。7.借助蛋白芯片平台高通量优势寻找与目的蛋白AIMP1相互作用的单个蛋白或蛋白家族,用于信号传递、基因表达调节、能量或物质代谢、细胞周期调控等方面研究;筛选出可以与AIMP1发生相互作用的蛋白ANP32A,并通过免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)实验验证细胞内AIMP1与ANP32A之间是否存在相互作用。8.MTT 比色法用于检测不同浓度的蟾毒灵对MM细胞增殖的作用。结果:1.基因芯片结果显示,在采集的大量MM病人样品中,AIMP1基因的表达显著高于意义未明单克隆免疫球蛋白血症(monoclonal gammopathy of undetermined significance,MGUS)和正常血浆(normal plasma,NP)(P<0.001);在 Assessment of Proteasome Inhibition for Extending Remission(APEX)临床试验结果中,高表达AIMP1的病人的OS显著低于低表达的病人;Kaplan Meier生存分析结果显示,在处于Total Therapy2(TT2)治疗的病人中,高表达AIMP1的病人的总生存期(overall survival,OS)和无事件生存期(event-free survival,EFS)均显著低于低表达的病人。经ELISA实验检测,MM患者血清中的AIMP1水平要高于正常人。2.经WB实验验证,AIMP1 shRNA和AIMP1 cDNA转染MM细胞并构建AIMP1稳定敲低与过表达的细胞模型成功。MTT检测细胞增殖的实验结果显示,与对照组细胞相比,AIMP1敲低的MM细胞增殖明显受到抑制,AIMP1过表达的MM细胞增殖明显受到促进。3.SDS-PAGE检测结果显示,使用镍柱纯化洗脱后得到蛋白样品,分子量与AIMP1分子量大小基本一致,无明显杂带,根据灰度值估算,AIMP1的纯度约为95.9%。4.经WB实验验证后,鼠源AIMP1过表达质粒瞬时转染至小鼠巨噬细胞Raw264.7后,细胞中AIMP1蛋白水平过表达。使用核因子λB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor κB ligand,RANKL)50 ng/μl 与巨噬细胞集落刺激因子(monocyte colony-stimulating factor,M-CSF)10 ng/μ1共同刺激 Raw264.7 细胞后,AIMP1过表达的Raw264.7细胞分化能力强于对照组,破骨细胞个数与大小均明显多于对照组,WB检测诱导后的Raw264.7细胞中NFATc1的蛋白表达情况,结果显示AIMP1过表达的Raw264.7细胞中NFATc1明显高于对照组;纯化蛋白AIMP1可以诱导鼠源巨噬细胞Raw264.7分化为破骨细胞,并随着蛋白浓度的增加,分化的破骨细胞个数与大小也随之增加;WB检测结果显示,不同浓度诱导后的巨噬细胞内NFATc1的表达伴随蛋白浓度的增高而增高5.根据转录组测序结果分析差异表达基因及GO富集与KEGG富集结果分析可得:在过表达与敲低AIMP1以及添加外源性AIMP1的细胞株中,MAPK、NF-κB等信号通路显著富集。6.MTT 比色法检测显示,不同浓度纯化蛋白AIMP1对MM野生型细胞ARP1、CAG、H929和OCI体外增殖具有促进作用,并呈剂量依赖性;WB检测显示,不同浓度纯化蛋白AIMP1对MM野生型细胞H929与OCI中MAPK通路中ERK1/2及其磷酸化蛋白的表达具有促进作用。7.借助芯片平台高通量优势寻找到与目的蛋白AIMP1相互作用的蛋白ANP32A,Co-IP结果验证两者之间存在相互作用力。8.MTT 比色法检测显示,不同浓度的蟾毒灵对MM野生型与过表达AIMP1细胞均存在抑制作用。结论:AIMP1高表达与MM患者复发预后相关。在体外,AIMP1过表达可以促进MM细胞增殖,并且促进RANKL介导的破骨细胞分化;AIMP1与ANP32A相互作用可能与MM的增殖有关。