目的:宫颈癌是世界范围内威胁妇女健康和生命的主要恶性疾病,是仅次于乳腺癌而引起妇女癌症相关死亡的重要原因。对于晚期宫颈癌和宫颈癌复发病例,化疗仍然是主要的治疗方法。但如果化疗药物长期大量的应用,药物在作用于肿瘤的同时还会引起严重的副反应,而且可导致肿瘤对化疗药物产生耐药性。寻求高效、低毒的化疗方法用于宫颈癌的治疗,特别是晚期宫颈癌的治疗,一直是临床医生努力探询的问题。TRAIL(TNF-relatedapoptosis-inducing ligand)又名Apo2L,是新近发现的肿瘤坏死因子TNF家族成员,因其能够选择性地诱导多种肿瘤细胞凋亡,但不影响正常细胞的生长分化,使其在肿瘤治疗方面具有潜在的应用价值,有望成为没有毒副作用的新型化疗药物。本研究以人宫颈癌Hela和Caski细胞株为对象,体外研究TRAIL在宫颈癌治疗中的可行性,以及TRAIL与传统的化疗药物顺铂联用时对宫颈癌细胞生长的影响及其作用机理,从而为TRAIL为应用于宫颈癌的治疗提供实验室数据。方法:1细胞培育:常规复苏冻存的Hela、Caski细胞接种于100ml培养瓶中, 37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内松盖培育,以0.25%胰蛋白酶消化传代。2细胞增殖实验:取对数生长的Hela、Caski细胞,制成浓度为4.5×10~4个/ml的细胞悬液,接种到96孔培养板中,每孔100μl,置于37℃、5%CO2培养箱中培养,培养24h后,弃上清,加入含药培养基,按以下三种方式加药(1)不同浓度TRAIL蛋白(10、20、50、100、200ng/ml)或顺铂(0.5、1.0、2.0mg/L),分别检测TRAIL和顺铂单独用药24小时、48小时对细胞的生长抑制作用;(2)100ng/ml的TRAIL蛋白和1.0mg/L顺铂共同作用24h,比较单独用药和联合用药作用的差异;(3) 100ng/ml的TRAIL蛋白和1.0mg/L顺铂序贯应用,即TRAIL或顺铂单独作用12h后,再序贯顺铂或TRAIL继续培养12小时,比较两种用药方式对细胞生长的抑制作用。每一浓度均设6个平行孔,同时设空白对照孔(只加培养基),加药培养上述时间后,每孔加入10μl浓度为5mg/ml的MTT溶液,放回培养箱继续孵育4小时。吸净上清液,每孔加入二甲基亚砜100μl,振荡器上振荡10min,用酶标光度仪在波长为490nm时测定每孔的吸光度(A)值。每个实验均重复3次取均值。3流式细胞仪检测Hela、Caski细胞TRAIL受体DR4、DR5、DcR1、DcR2的表达以及顺铂作用后对表达的影响取对数生长期细胞以4.5×104/ml的密度接种于培养瓶,置于孵箱中培养,待每瓶细胞生长至80-90%时,设对照组(仅加培养基)和加药组(加入含1.0mg/L顺铂的含药培基),继续培养24小时后,收集细胞,上样流式细胞仪检测TRAIL受体的表达。以检测样品荧光指数(FI)表示。实验重复三次取平均值计算顺铂处理前后细胞TRAIL受体表达的FI值。4 RT-PCR方法检测顺铂处理前后Hela、Caski细胞株DR4、DR5、DcR1、DcR2的表达取对数生长期细胞以4.5×104/ml的密度接种于培养瓶,置于孵箱中培养,待每瓶细胞生长至80-90%时,设对照组(仅加培养基)和加药组(含1.0mg/L顺铂的含药培基),继续培养8小时后,收集细胞按步骤进行RNA的提取,cDNA的反转录以及PCR的扩增。以DR4,DR5,DcR1,DcR2与内参照基因β-actin扩增产物电泳带的吸光度比值,表示目的基因的相对表达水平。实验重复三次,取平均值。5统计学方法:计量资料以均数±标准差( x±s)表示,两个样本均数的比较用t检验;三组及以上资料的比较,首先进行方差齐性检验,方差齐者用多组计量资料的方差分析进行比较,如有意义则采用q检验两两比较,p<0.05差异具有显著性意义。所有计算均用SPSS13.0软件包进行分析。结果:1 Hela、Caski细胞的形态学观察:倒置显微镜观察:对照组细胞生长状态良好,细胞伸展,呈不规则多角形。加药培养24h时细胞数目减少,细胞明显皱缩,体积变小,细胞间隙增大,有凋亡小体形成。2 TRAIL和顺铂对Hela、Caski肿瘤细胞生长影响:用不同浓度的TRAIL和顺铂处理人宫颈癌Hela、Caski细胞24h、48h后,表现出不同程度的细胞生长抑制作用,随着药物浓度和作用时间的增加,抑制率增高。各组抑制率与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。3顺铂和TRAIL蛋白联合后较单独用药对细胞的生长抑制作用增强,表现出明显的协同抑制肿瘤细胞生长的作用。联合用药后对Hela细胞的生长抑制率由单用TRAIL的13.34%增加到69.44%,对Caski细胞的抑制作用由单用TRAIL的35.44%增加到89.66%。4顺铂序贯TRAIL的方式较TRAIL序贯顺铂的加药方式对细胞生长的抑制作用有明显不同,前者加药方式对Hela和Caski细胞的生长抑制率分别为60.75%和79.88%,而后者加药方式分别为35.22%和55.73%,实验组之间两两比较差异显著,(P<0.01)。5 Hela和Caski细胞四种TRAIL受体均有表达,但表达的丰度有所不同。其中DR4,DR5表达的FI值明显高于DcR1,DcR2,Hela和Caski两种细胞之间表达比较没有差异。顺铂作用24小时后DR4和DR5表达被明显上调,Hela细胞DR4的FI值由用药前的1.80升高到2.20,DR5由用药前的1.82升高到2.44;Caski细胞DR4由用药前2.07的升高到2.35,DR5由用药前的2.14升高到2.55。实验组与对照组比较P<0.05,有统计学差异。但两种细胞的DcR1和DcR2表达较用药前后均无统计学变化。6 RT-PCR方法检测到顺铂处理Hela和Caski细胞8h后DR4、DR5表达水平明显升高,DR4分别为对照组的1.25倍和1.40倍,DR5为对照组的1.36倍和1.57倍,P<0.05,差异有统计学意义。DcR1,DcR2表达变化无统计学意义(P>0.05 )。结论: 1宫颈癌Hela和Caski细胞是TRAIL敏感细胞株。2顺铂可以增加宫颈癌Hela和Caski细胞对TRAIL蛋白的敏感性,两药合用有协同抗肿瘤作用。3顺铂通过上调宫颈癌Hela和Caski细胞株死亡受体DR4、DR5的表达,从而放大TRAIL蛋白的诱导肿瘤细胞凋亡作用。4死亡受体被顺铂上调的机制及其信号传导通路还需进一步认识。5诱骗受体在顺铂对TRAIL产生协同抑瘤作用中的作用尚不明确。