研究背景:软骨组织主要由软骨细胞、基质和纤维等成分构成,目前认为软骨细胞是软骨组织中唯一的细胞。根据所含纤维成分的不同,人们将软骨组织划分三种类型,分别为透明软骨、弹性软骨和纤维软骨。透明软骨主要见于关节软骨,分布在骨关节表面,机体内分布较为广泛;弹性软骨多见于耳廓鼻翼等部位,质脆;纤维软骨见于脊柱椎间盘,韧性特别大。关节软骨的胶原纤维属于致密结缔组织,软骨细胞分布于胶原纤维框架中,并维持关节软骨的正常代谢。关节软骨正常结构的维持需要适度的关节运动。关节软骨表面光滑且富有弹性,利于吸收、缓冲应力的作用,一旦关节软骨出现损伤,那么这种吸收缓冲作用明显下降,进而导致关节损伤、关节退行性病变进行性加重。卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone FSH）是由腺垂体分泌,属于糖蛋白激素类,是下丘脑-垂体-内分泌轴中的关键信号分子,FSH主要通过与促卵泡生成素受体（follicle-stimulating hormone receptorFSHR）结合发挥作用。先前普遍认为,垂体糖蛋白类激素受体仅仅存在于特异的内分泌的靶器官和靶组织,目前关于该受体在内分泌外组织分布的报道逐渐增多,但有些分布还是具有争议性的。在非经典组织中,糖蛋白激素受体含量通常处于较低的水平,往往只在特殊的发展阶段（如肿瘤发生或组织修复）呈阶段性表达。故而设定只有在特殊的情况下,例如当垂体功能衰竭时导致激素合成受抑制,或者内分泌功能衰竭导致的垂体功能亢进使得激素合成骤然增加,导致这些外周的非经典的糖蛋白激素受体被广泛激活进而产生明显的生物学效应。在女性,FSHR特异性的表达于卵巢颗粒细胞的细胞膜表面。FSH与FSHR发生特异结合,其复合物进而激活胞内信号传导通路,直接决定颗粒细胞的增殖、分化过程。FSHR在卵巢是否是高表达,对于卵泡发生、发育和成熟这一过程,起到关键的调控作用。而在男性,睾丸的支持细胞是FSHR特异性的表达部位,FSH通过与FSHR结合,调控机体的生精功能。早期关于FSHR在性腺外的表达的研究,多见于斑马鱼等较低等的动物,其研究报道FSHR表达于斑马鱼的肝肾组织。而在人类,脂肪组织为较早报道的表达FSHR的性腺外正常组织。发现了 FSH-FSHR信号调控前脂肪细胞分化的机制,为绝经期肥胖症的研究提供了新的切入点,开创了垂体糖蛋白受体研究的新领域。FSHR 是 G-蛋白偶联受体（G-protein coupled receptor GPCR）家族中的一员。FSHR与FSH结合,生理情况下,FSHR介导FSH调节卵巢颗粒细胞的正常生长和功能,促进卵子发育成熟及排出。研究表明,在遗传和环境因素作用下,FSHR发生基因突变,导致FSHR表达量减少,且破坏正常的信号转导。从而导致卵巢对促性腺激素刺激反应减退,出现孕育方面的问题。随着各项研究的深入,人们从以前单纯认为内分泌调节是通过各个功能“轴”来进行的,认识激素作用的水平停留在整体水平或组织器官水平上,逐渐的过度到器官的激素分泌系统和弥散性激素分泌系统。这些激素包括肽类、胺类等物质,它们通过多种形式,如内分泌、自分泌、旁分泌等,到达机体内环境的各处,发挥稳定作用,提供精细调节。骨性关节炎（osteoarthritis,OA）属骨关节疾病,膝关节为主要发病部位,在中老年人中尤其常见。研究指出关节软骨基质的破环是OA的最早期病理变化。骨性关节炎这一退化性的疾病的发生涉及整个关节结构。疾病的最主要特点是软骨的丢失和骨结构的变化,包括边缘生长,骨赘和硬化症。此外,OA也包含其他软组织结构,包括肌肉、肌腱和韧带无力,以及症状性滑膜炎症等。研究表明绝经后妇女发病率显著高于男性,低雌激素水平妇女发病率进一步增高。卵泡受FSH刺激分泌雌激素,而FSH也受雌激素的负反馈调节。当性腺功能出现下降时,如绝经期时,卵巢功能近乎衰竭,雌激素水平急骤下降,而FSH也处于较高水平。而在围绝经期,即使女性雌激素水平处于正常范围时,FSH水平已经明显升高。于是我们设想,在围绝经期及绝经期迅速升高的FSH,会不会直接参与OA的发生发展。由于FSH需要与FSHR结合方能发挥作用,那么可以推断出或许软骨组织具有FSHR分布。早期认为FSHR仅表达于性腺,也就是卵巢及睾丸组织。随着研究的不断深入,人们逐渐发现,在一些非卵巢组织细胞内也有FSHR的表达。例如脂肪组织、成纤维细胞、淋巴细胞、破骨细胞及神经细胞等。同时软骨细胞也表达多种激素受体,如生长激素受体、胰岛素样生长因子-1、糖皮质激素受体、甲状腺激素受体、雌激素受体、雄激素受体、维生素D受体、瘦蛋白受体等。软骨细胞的生长、分化受到多种激素直接或间接的调节。其中比较重要的激素包括甲状腺激素和生长激素,二者均可促进骺板软骨的生长发育成熟。那么软骨细胞会不会表达FSHR,当前尚没有着眼于FSH与软骨细胞分化和代谢的研究,对此我们进行了缜密的实验研究。结果令人欣喜,在软骨组织上我们确实发现FSHR的表达,目前检索文献显示尚没有FSHR在软骨组织表达的研究,我们首次报道了该受体表达及相关机制研究。对于软骨细胞上表达的FSHR我们进行了相关试验验证及初步机制探讨,首次提出FSH通过与FSHR结合调控软骨的研究,开创性的提出了该信号调控与绝经期骨性关节炎相关性研究的新方向,使得垂体糖蛋白受体研究领域进一步拓宽。研究目的:1、探讨软骨细胞中FSHR的表达;观察人正常软骨组织、小鼠软骨组织、体外培养的小鼠软骨细胞是否存在FSHR mRNA与蛋白的表达,以及小鼠软骨细胞原代细胞经Forscolin刺激后软骨细胞内cAMP的含量的改变,以明确软骨细胞表面的FSHR是否通过cAMP通路发挥活性功能。2、通过PCR Array检测,进行基因筛选,为将来研究FSH参与软骨功能的调节提供基础与依据,寻找FSH-FSHR针对软骨细胞作用的可能通路,探讨FSH对软骨细胞的初步作用机制。研究方法:1、人正常软骨组织及人卵巢组织标本的收集:人正常软骨组织（n=5）以及卵巢组织（n=3）均选择性取自山东省立医院临床膝关节或卵巢手术（软骨组织取自行膝关节置换术的患者;卵巢组织取自行卵巢癌切除术的患者,选取肿瘤周围相对正常的组织）;小鼠软骨组织（n = 6,）分别取自正常新生乳鼠,C57/BL小鼠。2、小鼠软骨细胞的培养:取DMEMF-12原装液500ml,加入0.22g抗坏血酸和0.065g抗坏血酸-2-磷酸盐。量取9体积的DMEMF-12培养液,加入1体积的胎牛血清,配置成含10%胎牛血清的培养液,最后加入青霉素和链霉素,青链霉素浓度为100 IU/ml培养液,即配成完全培养液。待培养皿中的软骨细胞长至80%～85%时,添加FSH处理。在处理前,先吸尽原完全培养液,并用PBS洗涤两遍,随后仅加入基础培养液培养过夜,最后添加相应处理。3、为验证软骨组织细胞内有无FSHR,选取人、小鼠正常软骨组织及培养的软骨细胞为研究对象,于此同时,分别选取人卵巢组织、小鼠卵巢组织作为阳性对照,进行如下各检测:①采用RT-PCR检测FSHRmRNA在软骨细胞内的表达;②采用正反两方向测序检测软骨组织细胞来源FSHR mRNA序列与卵巢组织来源FSHRmRNA序列的一致性;③采用western blot检测FSHR蛋白在软骨组织细胞内的表达;④采用免疫荧光试验进一步验证,软骨细胞内FSHR蛋白的表达及FSHR在软骨细胞内的定位。研究结果:1、FSHR mRNA在软骨细胞的表达及鉴定:通过采用多对针对FSHR不同基因位点的引物,经过RT-PCR试验,结果证实,在人的软骨组织、小鼠的软骨组织以及体外培养的小鼠原代软骨细胞内均有FSHRmRNA的表达。且测序结果证实从人卵巢组织及小鼠原代软骨细胞扩增得到的FSHR mRNA的序列结果与已知的从人卵巢组织获取的FSHRmRNA序列一致;2、FSHR蛋白在软骨的表达:蛋白质印迹法证实在上述组织细胞内同时存在FSHR蛋白的表达;而免疫荧光结果提示FSHR蛋白如同在卵巢细胞一样定位于软骨组织细胞膜表面;3、软骨细胞FSHR的功能研究:从新生乳鼠分离出的原代软骨细胞单层种植于培养皿上,FSH分别以0,5,10,20,40 ng/ml的浓度,对培养皿内软骨细胞进行刺激,选取Forskolin（100 mM）组作为阳性对照,FSH零浓度组为阴性对照,培养皿内加入IBMX（100 mM）。作用5分钟后收集细胞测定cAMP含量,测定蛋白浓度,校正cAMP值,结果显示Forskolin明显引起了 cAMP含量的增加,差异具有统计学意义,与阴性对照组相比FSH没有明显的引起软骨细胞cAMP含量增加,差异无统计学意义。通过对WNT信号通路大量基因分析,加入FSH刺激后,引起软骨细胞发生基因上调改变,有三个基因发生明显上调,分别为Fosll、Rhou、Dkkl。结论及意义:综上所述,在本课题研究中,我们首先通过RT-PCR检测证实,在人软骨组织、小鼠软骨组织细胞中均存在FSHRmRNA的表达,且通过测序分析证实软骨组织内表达的FSHR mRNA与软骨组织内的FSHR mRNA序列具有高度一致性;进而通过蛋白质印迹法与免疫荧光证实,在人软骨组织、小鼠软骨组织及原代细胞中存在FSHR蛋白的表达,且FSHR蛋白表达于软骨细胞膜表面;最后我们的研究发现,FSHR蛋白不能介导FSH刺激软骨细胞cAMP产量的增加,但通过PCR-Array证实软骨细胞FSHR具有功能活性,通过Wnt/β-catenin基因通路筛选出三个上调基因。鉴于软骨组织在关节运动中起到至关重要的作用,软骨细胞膜表面功能性FSHR的发现,具有重要的理论价值与应用前景。该发现将为FSH在软骨生理功能及病理生理过程中存在的潜在调控作用提供新的研究方向。为后期临床研究探讨卵巢功能异常与软骨功能改变之间的联系,提供新的研究思路及治疗靶点。