目前心肌梗死仍是发病率和死亡率较高的疾病之一。由于心肌细胞再生能力有限,坏死的心肌组织即使得到再灌注治疗也只能由无收缩功能的瘢痕组织替代,细胞移植治疗只能修复小面积心肌损伤,而组织工程技术为大面积心肌缺损提供了一个较好的治疗方法。组织工程包括种子细胞、支架材料和生物活性分子三大要素。干细胞由于具有自我更新和多向分化潜能将成为重要的组织工程种子细胞,但由于胚胎干细胞、骨髓干细胞以及诱导的多潜能干细胞存在着伦理道德或免疫排斥反应,甚至有致瘤的危险性,而脂肪干细胞由于来源简便充足,容易大量提取获得,移植后无免疫排斥反应,将成为组织工程比较有前景的种子细胞。因此我们用改进的方法分离培养脂肪干细胞,并对其增殖能力和多向分化潜能进行检测。通过胰酶和胶原酶联合分次消化和换液去除红细胞,我们改进了脂肪干细胞的分离方法,可从400～600mg脂肪组织收获约5×10~5个脂肪组织来源的干细胞,并且细胞可以重叠生长一个月以上,期间细胞表现出几个对数增殖期;所有增殖的细胞其干细胞相关表面标记(CD13,CD29,CD44,CD105和CD166)都呈阳性表达;多潜能细胞相关转录因子Nanog,Oct-4,Sox-2和Rex-1也呈强阳性表达;通过油红、甲苯胺兰、ALP、von Kossa及荧光染色证明脂肪组织来源的干细胞具有向多个胚层细胞分化的能力。此外,为获得更多具有强增殖能力的细胞,根据生长曲线,我们对细胞进行每14天传代而非常规的5天传代,发现所得到的细胞仍保持强的增殖能力、干细胞表型以及更强的多向分化潜能。制备适于种子细胞生长的支架材料也是构建工程化组织的关键。在各种生物材料中,天然生物材料胶原和壳聚糖都具有较好的生物相容性和生物可降解性,但胶原的机械强度差,而壳聚糖由于其晶体结构而较坚硬,因此结合胶原和壳聚糖来制备支架将可避免两种材料的缺点,从而制备出适于种子细胞生长的支架。我们采用冻干法制备不同比例的胶原—壳聚糖支架,研究支架的孔径、孔隙率、保水性、生物可降解性以及与脂肪干细胞的生物相容性。冻干后的支架内部呈海绵状多孔隙结构,其中以胶原/壳聚糖体积比为9:1的复合支架最为疏松,1:9的支架最致密。扫描电镜下支架的胶原含量越高,支架内的胶原丝越多,支架的孔与孔之间相互连通构成了通孔。交联前后支架的形态结构无明显改变。交联后体积比为9:1,7:3和5:5的复合支架孔径为50～200μm之间,可用于细胞的三维培养。体积比为5:5的复合支架的吸水性和含水量最高,7:3和3:7次之;多孔支架在水中未发生明显的溶胀现象;支架的孔隙率均在90%以上。交联后随着胶原含量的减少,降解速率减慢,交联后的复合支架降解速度较未交联慢。脂肪干细胞在支架上培养5d后扫描电镜和HE染色可见细胞在7:3的支架上爬行生长并融合成片,而5:5支架上黏附生长的细胞较少。组织工程构建过程中,提供适于种子细胞生长的微环境也是很重要的,体外细胞生长的环境要尽量模拟体内的三维动态微环境,而转瓶生物反应器可提供三维动态微环境,促进悬浮和贴壁细胞的增殖和分化。因此我们利用转瓶生物反应器提供三维动态微环境,对支架内的脂肪干细胞进行扩增,并检测扩增后干细胞的表型特性及多向分化潜能。脂肪干细胞在转瓶生物反应器中扩增14天后,与静态条件下相比,支架内的细胞具有更强的增殖活性,扩增倍数大约为26倍,而静态条件下细胞扩增倍数近20倍;所扩增的细胞能够保持原有的干细胞表型特性和多向分化潜能。局部微环境在干细胞的定向分化中起着决定性作用,而心肌样微环境可促进骨髓干细胞向心肌细胞分化,因此心肌样微环境也可能促进脂肪干细胞向心肌细胞分化。我们分别对脂肪干细胞和心肌细胞进行间接和直接共培养研究,并检测共培养后脂肪干细胞超微结构的变化以及心肌特异性蛋白和转录因子的表达。经2周共培养后,分化的脂肪干细胞呈现心肌样超微结构,并表达心肌特异性蛋白和转录因子,流式细胞仪分析结果显示,间接共培养2周后约20%的细胞表达心肌特异性蛋白,而直接共培养2周后约30～40%的细胞表达心肌特异性蛋白,并且直接共培养体系中分化的脂肪干细胞的心肌特异性蛋白和转录因子的表达率明显高于间接共培养体系中的表达率。在各种生长因子中,人胰岛素样生长因子(IGF-1)在心脏发生和发育过程中起着重要的作用,能促进早期心肌分化。因此我们利用IGF-1基因作为目的基因,整合到支架内并转染脂肪干细胞,应用心肌细胞培养基作为诱导培养基,转瓶生物反应器提供三维动态微环境,研究脂肪干细胞在胶原-壳聚糖支架内向心肌细胞分化的情况。结果显示动态微环境能促进质粒DNA的释放和转染;IGF-1可促进脂肪干细胞在胶原-壳聚糖支架内增殖以及向心肌细胞分化;动态微环境可加强IGF-1的促进脂肪干细胞增殖分化作用。本研究采用改进的方法可较容易的获得大量脂肪干细胞,并发现脂肪干细胞具有较强的增殖能力和多向分化潜能;所制备的胶原-壳聚糖多孔支架具有较好生物相容性和生物可降解性,适于脂肪干细胞的三维培养;所设计的支架—转瓶培养系统是一个简便有效的扩增脂肪干细胞的方法;心肌样微环境可促进脂肪干细胞向心肌细胞分化;将细胞生长的支架内的阳离子多聚物作为IGF-1基因转染的载体,这种转染方法较传统的方法更简易,效率更高;联合IGF-1基因、心肌细胞培养基和动态微环境多因素刺激,可促进脂肪干细胞在支架内向心肌细胞分化。此研究对体外构建工程化心肌样组织进行心肌再生有着重要的指导意义。