成骨不全(osteogenesis imperfecta,OI),又称脆骨病,是一种结缔组织异常可遗传疾病,临床表现包括:多发性骨折及长期骨折引起的骨骼畸形,脊柱侧弯,牙本质发育不全,蓝巩膜,皮肤弹性下降和关节松弛等。成骨不全是遗传性罕见疾病,儿童中的发病率不到万分之一,约90%的患者因为COL1A1和COL1A2基因突变,导致胶原蛋白合成数量及结构异常引起。突变蛋白堆积在细胞内质网中引发内质网应激(ER stress),内质网应激通过细胞自噬(Autophogy)对异常的胶原分子和前胶原蛋白进行降解,同时通过多种途径促进正常胶原蛋白的产生。研究目的:1)验证成骨不全患者原代细胞中内质网应激和细胞自噬的存在。2)初步探索内质网介导的细胞自噬对胶原蛋白合成的影响,为该病的治疗寻找新思路。研究方法:1)采集成骨不全患者和正常人骨、皮肤组织样本和临床信息。2)成骨/成纤维细胞原代培养并提取细胞RNA和全蛋白3)通过RT-q PCR,在基因水平进行内质网应激和细胞自噬的验证。4)通过免疫印记方法,在蛋白水平进行内质网应激和细胞自噬的验证5)通过透射电镜(50万倍)观察,应激细胞自噬过程的形态学表现。6)探索优化胶原蛋白的提取方法。7)利用氯喹等试剂,探索细胞自噬的信号通路。8)通过对胶原蛋白合成量的分析,判断抑制剂和激动剂对信号通路的影响。实验结果:1)组织处理及成纤维细胞培养成骨不全患者的皮肤和骨组织经处理后于细胞培养瓶内进行贴壁培养,在含有10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM培养基中,24h内开始贴壁,贴壁效果良好。2)内质网应激验证试验与对照组相比,成骨不全患者原代成纤维细胞中提取的核酸分析结果显示,内质网应激相关基因Bip上调1.5-2.5倍,GRP94上调2.1-3.3倍,ERp72上调1.38-2.4倍,Hsp47上调1.6-2.7倍。内质网应激相关蛋白,Hsp47实验组条带明显,对照组无明显条带;Bip、Grp94、Erp72实验组蛋白表达量分别是对照组7.56倍、7.34倍和3.54倍。3)细胞自噬验证试验与对照组相比,实验组细胞自噬相关基因p62上调2.2-2.4倍,LC3上调1.7-3.2倍。利用免疫酶标技术分析蛋白表达量差异,结果显示,对照组只表达LC3I型蛋白,实验组同时表达LC3I型和LC3II型蛋白,表达量是对照组3.08倍。4)自噬小泡观察透射电镜观察结果,成骨不全患者原代体细胞中出现了自噬小泡。5)胶原蛋白提取方法的探索实验结果表明从细胞中和培养液中提取的胶原蛋白,最适的胃蛋白酶消化时间为5小时,作用浓度1mg/m L。培养液中抗坏血酸浓度在0.1~0.15m M之间,β-氨基丙腈浓度达到0.1m M时,连续培养96h以上胶原蛋提取量最理想。6)自噬抑制剂和激活剂对成骨不全成纤维细胞生长影响初步结果发现,成骨不全成纤维细胞自噬通路部分抑制后,有利于细胞的存活,自噬加强后细胞快速死亡。7)细胞自噬对胶原蛋白合成的影响实验结果表明,在成骨不全患者体细胞中,自噬激动剂明显抑制胶原蛋白的合成,自噬抑制剂可以提高胶原蛋白亚基和成熟胶原的合成。结论:通过一系列的实验证实,成骨不全患者的成纤维细胞中存在明显的内质网应激现象,与胶原蛋白修饰折叠相关的分子伴侣表达量明显提高,以促进胶原蛋白的正常折叠和产生。同时,由于蛋白的积聚,引发内质网应激,启动细胞自噬,降解异常胶原蛋白,缓解应激压力。在成骨不全患者成纤维细胞中,细胞自噬信号通路受多种抑制剂和激动剂调控,实验结果显示,细胞自噬部分抑制后,有利于细胞的生存及胶原蛋白的合成量,本结果可能为成骨不全治疗方法的探索提供了新的思路。