一、研究背景国家卫生部组织的居民营养和健康状况调查资料显示,随着营养饮食等生活方式的不断改变,高血压、糖尿病、肥胖及代谢综合征等慢性疾病的发病率呈现逐年上升趋势。近年来循证医学发现,胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)在高血压、糖尿病等慢性疾病的发生发展以及靶器官损害中扮演着重要角色。胰岛素抵抗是指胰岛素介导的葡萄糖摄取和利用降低,机体为了保持内在环境稳定和血糖正常,代偿性地引起高胰岛素血症(Hyperinsulinemia)。许多患者在表现胰岛素抵抗的同时,往往伴随高胰岛素血症,通过引起肾脏的水钠潴留以及促进血管平滑肌细胞增殖等生理作用在高血压等多种疾病的发生发展及其靶器官损害中发挥重要的作用。目前认为,胰岛素抵抗及其伴随的高胰岛素血症是高血压、糖尿病等多种疾病的异常生理状态与共同危险因素,肾脏是上述疾病及其并发症的重要靶器官之一,对钠水代谢的影响便是其作用的主要效应之一。稳定的水钠代谢平衡是正常人体应具备的最基本营养状态与正常生理状态之一。肾脏作为人体负责水钠排泄的重要器官,它可以调节尿钠重吸收,稳定机体的水电解质平衡,从而影响血压的变化,水钠代谢的失衡将直接导致血压的升高,比如原发性高血压(Essential hypertension)病人体内存在的水钠潴留就是一个普遍现象。肾脏对尿钠排泄的调节作用是近年医学研究的热点之一。尿钠排泄受到多种体液因素的调节影响,其中,多巴胺、胰岛素与各自受体的作用在尿钠排泄中的作用均值得关注。近年来,多巴胺在调节尿钠排泄及血压方面的重要作用逐渐为人们所认识。多巴胺通过其相应的多巴胺受体在肾脏中发挥利钠排水的作用。当体内钠负荷超载时,肾脏的多巴胺受体负责超过50%的钠排泄,从而在水钠代谢平衡以及血压的调控等方面发挥了重要的作用。高血压状态下,多巴胺受体介导的利尿排钠作用明显障碍。多巴胺受体分为D1类(D1、D5)、D2类(D2、D3、D4)受体两大类型。肾脏近曲小管(Renal proximal tubule, RPT)是多巴胺重要的合成部位之一,而此部位的尿钠排泄效应主要是由多巴胺D1类受体完成。近年来的研究表明,多巴胺D5受体在调节尿钠排泄、保持机体水电解质平衡、调控血压等方面具有重要作用。多巴胺D5受体在RPT段有丰富的表达,并且多巴胺D5受体与多巴胺的亲和能力要高于多巴胺D1受体;多巴胺D5受体介导的利钠排水的生理效应也已得到基因敲除小鼠实验结果的支持。另外,多巴胺D5受体还可以通过与其他水钠代谢与血压调节系统相互作用,参与肾脏尿钠排泄和血压的调节,如多巴胺D5受体可以影响肾脏的氧化应激、多巴胺D5受体介导了多巴胺D1类激动剂对肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system,RAS)的血管紧张素II受体1(AT1R)的降解作用、多巴胺D5受体还可以通过与G蛋白亚基Gα12和Gα13的相互联系影响NHE3的活性等。目前仅有少量研究发现胰岛素与多巴胺受体亚型之间具有一定的相互作用。但是,作为在尿钠排泄等诸多方面发挥重要作用的多巴胺D5受体,是否也与胰岛素之间具有一定的作用并未见报道。根据多巴胺受体之间具有的一定的功能相似性,而且胰岛素受体与多巴胺D5受体都在肾脏中具有良好的表达,多巴胺D5受体与胰岛素受体同属于膜受体,多巴胺与胰岛素与各自受体的结合将从相反的方面影响水钠排泄:即多巴胺D5受体介导了尿钠排泄,而胰岛素则将导致水钠潴留。因此,我们推测胰岛素可能通过胰岛素受体对多巴胺D5受体在肾脏的表达具有影响;进一步,胰岛素通过影响多巴胺D5受体的表达将可能影响到多巴胺D5受体介导的尿钠代谢功能,进而对肾脏尿钠排泄、机体水电解质平衡以及血压水平的高低等产生一定影响;而且,这样的影响或调节作用在正常与异常的生理状态下(高血压)可能会存在有一定的差异。因此,基于以上分析,本课题在正常血压WKY大鼠(Wistar-Kyoto rat)与自发性高血压大鼠(Spontaneous hypertensive rat,SHR)来源的肾脏近曲小管上皮细胞中研究了胰岛素对多巴胺D5受体表达的影响;在多巴胺D5受体转染的HEK293细胞(HEK-D5)中研究了胰岛素对多巴胺D5受体介导的尿钠代谢功能的影响,并在转染多巴胺D1受体反义寡脱氧核苷酸(Antisense oligodeoxyribonucleotide,AS-ODN)的WKY与SHR的RPT细胞中对该效应进行了对比;同时,利用激光共聚焦、免疫沉淀等方法研究了多巴胺D5受体与胰岛素受体之间在RPT细胞中可能存在的共表达以及物理连接,并深入探讨了胰岛素对多巴胺D5受体作用中可能涉及的分子机制。以上问题的解决,将有助于揭示胰岛素与多巴胺D5受体在调节尿钠重吸收,稳定机体水电解质平衡以及血压水平等方面相互制约的彼此作用,具有重要的生理意义;进一步丰富和完善胰岛素抵抗在原发性高血压中引起肾脏尿钠排泄障碍以及血压失调的作用机理;同时,对于胰岛素抵抗、高胰岛素血症、高血压等异常生理状态下的肾脏靶器官的损害及保护提供重要的理论依据。二、研究内容和方法1.以WKY及SHR大鼠的RPT细胞株作为研究对象,采用免疫印迹与免疫组织化学方法观察胰岛素对RPT细胞中多巴胺D5受体蛋白表达的影响,应用RT-PCR方法研究胰岛素对多巴胺D5受体mRNA水平的改变,对比以上蛋白与mRNA水平的表达变化在WKY及SHR大鼠的RPT细胞中的差异。2.以HEK293细胞以及多巴胺D5受体转染的HEK293细胞(HEK-D5)为研究对象,分别观察多巴胺D1类受体激动剂fenoldopam与胰岛素对Na+-K+-ATP酶活性的影响,并研究在预刺激胰岛素情况下,fenoldopam对HEK-D5细胞中Na+-K+-ATP酶活性作用的变化。3.利用反义寡核苷酸技术对RPT细胞中的多巴胺D1受体进行阻断。然后,分别在转染多巴胺D1受体AS-ODN的WKY与SHR的RPT细胞中,观察多巴胺D1类受体激动剂fenoldopam对Na+-K+-ATP酶活性的影响,并研究在预刺激胰岛素情况下,fenoldopam对细胞Na+-K+-ATP酶活性作用的变化,并对比该变化在WKY与SHR细胞中是否具有一定的差异。4.以WKY大鼠的RPT细胞作为研究对象,观察在分别预先阻断酪氨酸激酶、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)以及蛋白激酶C(PKC)等信号途径的情况下,胰岛素对多巴胺D5受体调节作用的变化,深入探讨胰岛素作用多巴胺D5受体的可能分子信号途径。5.以WKY及SHR大鼠的RPT细胞株作为研究对象,采用激光共聚焦显微镜技术观察多巴胺D5受体和胰岛素受体在RPT细胞上的各自表达情况以及两种受体是否存在受体共存现象。6.利用免疫沉淀方法,检测WKY及SHR大鼠的RPT细胞中多巴胺D5受体和胰岛素受体是否存在物理连接,胰岛素作用后,物理连接是否发生改变,并对比这样的改变在WKY及SHR大鼠的RPT细胞中是否具有一定差异。7.利用免疫印迹方法观察胰岛素作用WKY及SHR大鼠的RPT细胞中后,对胰岛素受体自身表达状态的改变,并比较该变化在WKY及SHR大鼠的RPT细胞中是否具有一定差异。三、研究结果1.胰岛素通过胰岛素受体可以提高正常血压大鼠(WKY)来源RPT细胞中的多巴胺D5受体的蛋白表达,其作用呈现一定的浓度与时间依赖性关系;但是,在自发性高血压大鼠(SHR)来源的RPT细胞中,胰岛素却降低了多巴胺D5受体的蛋白表达,其作用效果同样随着作用浓度的增加与时间的延长而增强。在基础状态下,SHR的RPT细胞多巴胺D5受体蛋白表达要低于WKY细胞。而且,不论是在WKY还是SHR细胞中,胰岛素对多巴胺D5受体的影响均伴有mRNA水平的变化。2.在多巴胺D5受体转染的HEK293细胞(HEK-D5)中,胰岛素短时间作用可以显著提高细胞的Na+-K+-ATP酶活性,增强尿钠重吸收效应;但是胰岛素长作用24h后,洗脱胰岛素并换为无胰岛素培养基放置3h,细胞的Na+-K+-ATP酶活性可以恢复到正常水平,与对照相比没有明显差异。3.在多巴胺D5受体转染的HEK293细胞(HEK-D5)中,多巴胺D1类受体激动剂fenoldopam可以通过与多巴胺D5受体的作用,明显降低HEK-D5细胞的Na+-K+-ATP酶活性,发挥多巴胺D5受体介导的尿钠排泄作用;但是与之相反的是,fenoldopam对HEK293细胞的Na+-K+-ATP酶活性并没有显著影响。4.在多巴胺D5受体转染的HEK293细胞(HEK-D5)中,相对于单独的fenoldopam对细胞Na+-K+-ATP酶活性的降低效应,胰岛素预先处理细胞24h后,可以增强多巴胺D5受体介导的降低Na+-K+-ATP酶活性的生理功能,加强了多巴胺D5受体介导的尿钠排泄效应。5.多巴胺D1受体反义寡脱氧核苷酸可以有效阻断RPT细胞中多巴胺D1受体的表达。在转染多巴胺D1受体反义寡脱氧核苷酸的WKY的RPT细胞中,胰岛素预先作用可以增强fenoldopam对细胞Na+-K+-ATP酶活性的降低效应;在转染多巴胺D1受体反义寡脱氧核苷酸的SHR的RPT细胞中,胰岛素预先作用后却削弱了细胞中多巴胺D5受体介导的尿钠排泄功能。6.胰岛素在WKY来源的RPT细胞中对多巴胺D5受体的调节作用与酪氨酸激酶、PI3K以及PKC等分子信号途径有关。同时,在WKY与SHR来源的RPT细胞与HEK-D5细胞中,胰岛素作用后对胰岛素受体自身蛋白表达的降低作用可能与其生理效应也具有一定关系。7.在WKY与SHR来源的RPT细胞上,多巴胺D5受体与胰岛素受体不但具有各自的蛋白表达,而且两种受体还在WKY与SHR的RPT细胞中均具有共表达与受体共存现象。免疫共沉淀方法也证实了多巴胺D5受体和胰岛素受体之间在WKY与SHR的RPT细胞中均存在物理连接,但是SHR细胞中两种受体的基础连接状态要显著低于WKY细胞。刺激胰岛素受体后,可以明显降低WKY与SHR的RPT细胞中多巴胺D5受体和胰岛素受体之间的物理连接程度,但是胰岛素对WKY细胞中两种受体间连接程度的降低幅度要明显大于SHR细胞。综上所述,胰岛素通过胰岛素受体可以提高正常血压大鼠(WKY)来源RPT细胞中的多巴胺D5受体的表达,增强多巴胺D5受体介导的降低Na+-K+-ATP酶活性的生理效应,这在多巴胺D5受体转染的HEK293细胞(HEK-D5)中也得到了证实。多巴胺D5受体在肾脏表达与功能的增强是对胰岛素抵抗或高胰岛素血症的一种拮抗或制衡效应,通过多巴胺D5受体表达介导的尿钠排泄效应的增强,以此减轻胰岛素对肾脏的尿钠排泄功能的损伤,降低尿钠重吸收作用,从而在肾脏的水钠代谢、血压调控以及靶器官保护中发挥重要功能。但是,在自发性高血压大鼠(SHR)来源的RPT细胞中,胰岛素却降低了多巴胺D5受体的表达情况,并削弱了细胞中多巴胺D5受体介导的尿钠排泄功能。相对于正常血压大鼠,多巴胺D5受体介导的水钠排泄效应对胰岛素钠水潴留的拮抗效应在SHR中不但没有得到强化,正常的制衡效应反而却是有所缺失或失调,这将导致肾脏钠水排泄的进一步失控,钠水重吸收可能进一步增加。胰岛素对RPT细胞肾脏多巴胺D5受体的调节与酪氨酸激酶、PI3K以及PKC等信号途径有关。同时,胰岛素作用RPT后对多巴胺D5受体与胰岛素受体在物理连接状态以及胰岛素受体的自身改变等均可能参与了胰岛素对RPT细胞肾脏多巴胺D5受体的调节作用。本研究揭示了胰岛素与多巴胺D5受体在调节尿钠重吸收,稳定机体水电解质平衡以及血压水平等方面的相互制衡效应;丰富和完善了胰岛素抵抗在原发性高血压中引起肾脏尿钠排泄障碍以及血压失调的发病机理;对于胰岛素抵抗、高胰岛素血症、高血压等异常生理状态下的肾脏靶器官的损害及保护提供重要的理论依据。