版纳微型猪近交系(BMI)是全球第一个大型哺乳类实验动物近交系,在生物和医学领域有广泛应用前景。但在35年的繁育过程中有多个亚系断代,前期研究发现主要是由一些公猪不育造成,这些不育公猪已成为阻碍其群体数目继续扩大的主要屏障,亟待解决。哺乳动物精子发生是曲精细管上皮细胞连续经历有丝分裂、减数分裂和精子形成,发育成完整形态精子的细胞分化过程,高度有序,涉及众多结构、功能基因调控。目前BMI精子发生机制的研究尚属空白,其公猪不育的机理尚不清楚,筛选和鉴定BMI精子发生关键基因,并研究其蛋白功能,有助于近交系精子发生机制的揭示和雄性不育分子诊断方法的建立,具有重要的理论意义和应用前景,也可为人类男性不育的研究提供参考。本研究选取国内外文献高频率报道的与哺乳动物雄性不育相关的精子发生关键基因家族为候选基因,这些基因包括睾丸特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族(包括TSSK1-4和TSSK6)、胞质分裂基因家族(包括Septin1-12和Septin14)、无精子症基因家族(包括DAZL和BOLL)和睾丸蛋白DEAD-box家族(包括DDX25和DDX3Y)。通过PCR和5’RACE技术获得其完整CDS序列,进一步对其序列特征、时空表达规律、启动子特征、表达产物的亚细胞定位进行研究,最后初步探索了利用RNA干扰和基因过表达技术研究DDX3Y基因的表达调控,从而为深入研究BMI精子发生的分子机理及调控机制奠定基础。取得的主要研究结果如下:1.基因克隆、生物信息学分析及组织表达谱研究克隆得到BMI TSSK家族、Septin家族、DAZ家族和DEAD-box蛋白家族共22个基因的cDNA序列,提交到GenBank获得了认证。特别地,相对于牛和人BOLL基因的翻译起始密码子ATG,BMI BOLL基因为AAG,发生了 T到A的突变,致使BOLL基因丢失了起始密码子,不能翻译成蛋白,提示BMIBOLL基因失去表达活性,可能变为假基因;大白猪、长白猪、黑猪与BMI的结果类似,推测猪BOLL基因起始密码子缺失可能具有普遍性,但有待进一步证实。其余21个候选基因编码的氨基酸序列与人的同源性达77%以上,高度保守,序列的相似性提示这些基因的功能在物种间具有相似性。在SMART数据库中对这些氨基酸序列进行可能的结构域搜索发现,TSSK家族均含S_TKc催化结构域,Septin家族均含Septin/CDC_Septin功能结构域,大部分成员在近C端含有coiled coil结构;DAZL含有RRM结构域和DAZ重复;DDX25和DDX3Y含有DEXDc和HELICc结构域。结构域是蛋白质分子中能独立存在的功能单位,结构域的存在提示我们研究的这些基因均是功能基因,参与BMI的生命活动。在TSSK家族和Septin家族多物种氨基酸序列同源性比对基础上,构建的系统进化树表明TSSK家族可分为3组(A、B和C):Group A包含TSSK1和TSSK2,Group B包含TSSK3和TSSK6,Group C包含TSSK4;Septin家族也可分为3组(A、B和C),Group A 包含 Septin6、8、10、11 和 Septin14,Group B 包含 Septin1、2、4、5 和 Septin7,Group C包含Septin3、9和Septin12。同一组内的成员,基因结构上具有更高的相似性,推测具有更加类似的功能。利用RT-PCR的方法证实上述22个基因的组织差异表达现象,14个基因(TSSK6、Septin1-11、DDX25和DDX3Y)在多种组织中都有转录。特别地,TSSK2、BOLL和DAZL为睾丸特异性表达基因;TSSK1、TSSK3、TSSK4、Septin12和Septin14基因为睾丸和精囊腺特异性表达基因;睾丸和精囊腺均为雄性动物的重要生殖器官,在这两种组织的特异表达提示这些基因在BMI生殖发育过程中可能发挥重要的功能。下一步就以睾TSSK2、Septin12、Septin14、DAZL、BOLL和DDX3Y基因为关键基因,深入研究其功能。2.发育表达谱、蛋白水平上的组织表达谱及启动子分析利用 qPCR 的方法证实 BMI TSSK2、Septin12、Septin14、BOLL 和 DAZL 基因的mRNA在初生公猪睾丸中不表达,在2.5月龄公猪睾丸中的表达量极显著提高(p<0.01),5-18月龄间表达量无显著差异,至36月龄时有极显著下降,保持较低水平,与BMI精子发生时间基本一致,提示这些基因与BMI精子的发生具有关联性。进一步,对BMI TSSK2和DDX3Y基因进行原核表达,并利用其原核表达蛋白制备了特异性抗血清用于Western blot研究。Western blot结果证实了 TSSK2、Septin12、Septin14、DAZL和DDX3Y蛋白的天然存在;且TSSK2、DAZL和DDX3Y蛋白特异表达于睾丸,Septin12和14蛋白特异表达于睾丸和精囊腺组织。利用 PCR 扩增和克隆测序获得了 BMITSSK2、Septin12、Septin14、DAZL 和 DDX3Y基因的启动子区,发现TSSK2、DAZL和DDX3Y 5’侧翼区存在一个CpG岛,且位于启动子核心区域,为进一步从甲基化角度研究基因表达调控提供实验依据。3.细胞定位分析及BMI DDX3Y基因表达调控的初步探索细胞内定位结果显示TSSK2在线粒体和细胞核均有分布,主要在细胞核;Septin12和Septin14定位于核周围的线粒体;DAZL和DDX3Y定位于细胞核;与生物信息学预测的结果基本一致;每种细胞结构均含有一组特定的蛋白,具有特定的功能,细胞定位结果可为深入研究相关蛋白的生物学功能提供重要线索。利用过表达和RNAi技术初步探索了猪睾丸细胞系中DDX3Y基因的表达,结果表明:与对照组DDX3Y mRNA的表达相比,过表达组显著上调,干扰组显著下调,为后续深入研究奠定了基础。