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目的:已有研究证实TLRs/NF-κB信号通路在流感病毒感染细胞后发挥先天抗病毒免疫反应,本研究在探讨病证结合模型建立的必要性的基础上,采用PLS筛选评价肾阳虚外感造模方法,建立稳定的、有代表性的肾阳虚外感病证结合模型。基于方证相应的理论指导,从TLR3-TRIF-NF-κB信号通路分析麻黄细辛附子汤干预肾阳虚外感的药效机制及明确其作用靶点。方法:1、不同因素所致肾阳虚外感模型的筛选:腹腔注射苯甲酸雌二醇/氢化可的松,然后滴鼻感染流感病毒H1N1/H3N2建立四种肾阳虚外感模型,采用偏最小二乘法综合分析各项指标评价并筛选最佳模型。2、采用腹腔注射苯甲酸雌二醇,然后滴鼻感染流感病毒H1N1的方法建立肾阳虚外感模型,用麻黄细辛附子汤进行干预治疗,并使用偏最小二乘法对结果进行分析评价其药效作用。3、运用Western-Blot、RT-PCR等技术检测小鼠肺组织中甲型流感病毒H1N1、TLR3、TLR7、TRIF、My D88及NF-κB(P50)的m RNA及蛋白表达,分析麻黄细辛附子汤干预肾阳虚外感可能作用的靶点。结果:1、四种肾阳虚外感模型小鼠都在一定程度上出现了皮毛竖立,无光泽,精神萎靡、嗜睡等肾阳虚症状。与正常对照组比较,苯甲酸雌二醇组肛温、趾温、游泳时间极明显降低(P<0.01);氢化可的松组趾温显著性降低(P<0.05),自主活动时间、游泳时间有降低的趋势但无显著性差异。接种病毒后,正常对照组小鼠无死亡,各模型组小鼠均有不同程度的死亡,苯甲酸雌二醇H1N1组小鼠死亡率达23.07%;与正常对照组比较,四个模型组的肺指数都有明显升高且有显著性差异(P<0.05)。2、用PLS对体重、肛温、趾温、死亡率、脏器指数等指标进行分析得出各给药组对肾阳虚外感模型小鼠都体现出了一定的治疗效果,麻黄细辛附子汤中剂量组表现出了更加良好的治疗效果。3、Western-Blot及RT-PCR实验结果表明,与正常对照组比较,肾阳虚外感模型组小鼠肺组织中的甲型流感病毒H1N1、TLR3、TLR7、NF-κB(P50)的m RNA表达量及TLR3、TRIF、My D88及NF-κB(P50)的蛋白表达量显著升高(P<0.05);经药物干预治疗后,与肾阳虚外感模型组比较,各给药组小鼠肺组织中甲型流感病毒H1N1、TLR3、TLR7、TRIF、My D88和NF-κB(P50)的m RNA及蛋白表达量基本上呈下降的趋势,其中麻黄细辛附子汤治疗更好。结论:1、PLS得分图及二维图证实采用腹腔注射苯甲酸雌二醇+滴鼻感染甲型流感病毒H1N1的方法可以建立典型的肾阳虚外感模型。药物干预后,各给药组综合药效得分图及比较图可以看出麻黄细辛附子汤中剂量组有较好的治疗效果。中剂量相当于临床的等效剂量,这也提示麻黄细辛附子汤使用时要注意选择合适的剂量范围。通过实验可以得出使用PLS来分析处理药理学数据简便可靠,能较好地反映证候及中药复方整体、调控作用的特点,避免仅通过评价某一个或几个指标而得出片面结论的弊端,为中医临床上辨证选方、辨病用药提供了更客观的实验依据。2、Western-Blot、RT-PCR的实验证明麻黄细辛附子汤可以改善肾阳虚外感模型小鼠的各项体征,减轻造模引起的肺部病变,提高小鼠的生存质量,下调小鼠肺组织中升高的甲型流感病毒H1N1、TLR3、TLR7、TRIF、My D88及NF-κB(P50)的m RNA及蛋白表达量,通过抑制TLR3-TRIF-NF-κB信号通路的激活或者降低其中关键分子的表达来发挥先天抗病毒免疫反应。