【摘 要】
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安莎类化合物的生物合成起始于3-氨基-5-羟基-苯甲酸（AHBA）,然后在Ⅰ型聚酮合酶的作用下,进行脂肪链的延伸,最后经过环化和后修饰形成了不同的安莎类化合物。本研究利用张会图博士等初筛得到的33株AHBA基因阳性菌,进一步设计兼并性引物,进行PCR复筛,证实AHBA生物合成基因簇中的三个保守基因：AHBA合酶基因（K）、氧化还原酶基因（L）、磷酸酶基因（M）的存在,从而确证AHBA-KLM基因簇
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安莎类化合物的生物合成起始于3-氨基-5-羟基-苯甲酸（AHBA）,然后在Ⅰ型聚酮合酶的作用下,进行脂肪链的延伸,最后经过环化和后修饰形成了不同的安莎类化合物。本研究利用张会图博士等初筛得到的33株AHBA基因阳性菌,进一步设计兼并性引物,进行PCR复筛,证实AHBA生物合成基因簇中的三个保守基因：AHBA合酶基因（K）、氧化还原酶基因（L）、磷酸酶基因（M）的存在,从而确证AHBA-KLM基因簇（AHBA synthase gene cluster）的存在,复筛得到具有安莎类抗生素生物合成潜力的22株AHBA-KLM基因簇阳性菌株。经过克隆、测序和多序列比对以及构建的AHBA-KLM基因簇进化树分析、并把AHBA-KLM基因簇序列提交GeneBank,一方面为分析这些菌株所产生的化合物类型提供了重要的参考信息；另一方面,这22株AHBA-KLM基因簇序列的等同性约70%,也提示我们,可以针对这部分基因的保守性,探讨构建基因双交换阻断的通用载体。AHBA合酶基因（K）、氧化还原酶基因（L）、磷酸酶基因（M）三个基因不仅保守而且紧密连锁,经过22株AHBA-KLM基因簇进化树分析,以3-27菌株的序列为模板,采用Red/ET重组的方法,构建了针对这22株菌的基因双交换阻断的通用载体。利用构建的基因双交换阻断通用载体,通过ET12567/pUZ8002的基因结合转移系统,对同源性较高的4088、3-20、3-27和24-59,以及位于进化树不同分支的24-100、8-32、7-32、4353和4-124菌株进行基因双交换阻断。实现了这9株菌的双交换阻断,证实了,我们利用基因簇的保守性,构建基因双交换阻断通用载体理论的可行性。9株AHBA-KLM基因簇失活变株及其对应的原株进行发酵。经过多种手段,初步确定了3-20-1、3-27-1、24-100 （18min）、7-32 （23min）、8-32 （23min）可能为萘安莎的利福霉素类化合物；3-20-2、3-27-2、4-124（21min）、24-100 （21min）、4353 （32min）、4088（26min）、24-59（14min）、7-32（24min）和8-32（24min）可能为苯安莎的格尔德霉素类化合物；LC-MS确证了4088（26min）是格尔德霉素及其类似物；ESI-MS确证了3-27-1为利福霉素SV。本研究证实了利用保守性的AHBA-KLM基因簇,从放线菌筛选与之相关化合物的可行性；利用基因簇的保守性,构建基因双交换通用载体的可行性；利用AHBA-KLM基因簇双交换阻断技术可以快速确定发酵物中的安莎类化合物,为进一步的分离纯化和结构解析以及新结构的安莎类化合物的寻找提供了明确的指示作用。
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