仁扇舟蛾（Clostera restitura）是重大杨树食叶害虫之一,具有产卵量大、孵化率高和繁殖快等特点,再加上研究背景较为薄弱,没有针对性的防治策略,一旦爆发成灾,很难有效防控,因此,开发新型防治方法具有重要意义。通过开展仁扇舟蛾昆虫嗅觉识别系统的研究,揭示昆虫生存策略,可为利用化学生态调控手段有效防治仁扇舟蛾奠定坚实的基础。本研究利用Illumina Hiseq TM 2000高通量测序平台对仁扇舟蛾雌、雄虫触角进行转录组测序,通过生物信息学分析和同源比对等方法获得了仁扇舟蛾嗅觉相关蛋白候选基因;通过实时荧光定量方法对气味结合蛋白、化学感受蛋白基因进行了表达模式分析和RACE（Rapid applification of c DNA ends）克隆,筛选出关键基因进行原核表达和蛋白功能分析,采用同源建模和分子对接方法预测气味结合蛋白与气味配体结合情况,进一步明确其结合特性,最后对雌、雄虫进行触角电位分析,探寻对仁扇舟蛾具有刺激作用的植物挥发物成分。主要研究结果如下:1.通过Illumina Hiseq TM 2000高通量测序平台对仁扇舟蛾雌、雄虫触角进行转录组测序,共鉴定出165个嗅觉相关基因,其中包括43个气味结合蛋白（Odrant binding proteins,OBPs）,13个化学感受蛋白（Chemosensory proteins,CSPs）,78个气味受体（Odorant receptors,OR）,15个离子受体（Ionotropic receptor,IRs）,13个味觉受体（Gustatory receptor,GRs）,3个感受神经元膜蛋白（（Sensory neuron membrane proteins,SNMP））;对43个基因进行序列分析发现,其中27个OBP基因具有完整的开放阅读框和15～30不等的氨基酸组成的信号肽;通过Blastx比对、系统发育分析和motif图谱构建,鉴定出仁扇舟蛾普通气味结合蛋白（General odorant binding proteins,GOBPs）和信息素结合蛋白Pheromone binding proteins,PBPs)基因。对13条CSP基因进行序列分析可知,所有基因均符合C1-X6-8-C2-X18-19-C3-X2-C4结构通式;序列比对结果显示,Cres CSP与其它鳞翅目昆虫CSP基因序列相似度不低于55%;motif图谱分析发现,各图谱之间只存在motif数量的区别,位置相对OBP motif图谱更加保守,说明CSP基因在进化过程中的保守性。挖掘出的78个OR基因中,28个有较为完整的编码区,包含5～8个跨膜域,结合Blastx比对和系统发育树分析,鉴定出Cres102169为非典型气味受体Orco,Cres102537、Cres106862和Cres98888为PRs。2.对仁扇舟蛾OBP雌、雄差异基因进行克隆和序列分析,获得8个OBP基因全长序列,分析结果表明8个OBPs N-端均包含17～23个氨基酸构成的信号肽序列,其中Cres OBP10为Minuc-C OBP,其它7个均有6个保守的半胱氨酸位点,满足Classic OBP结构通式,8个OBP基因在雌、雄虫不同日龄和组织中表现出多样的表达模式,均在触角中高表达,说明触角作为主要的嗅觉器官在其嗅觉识别过程中发挥重要作用,Cres OBP10在雌、雄成虫足中有较高表达量,暗示Cres OBP10参与非挥发性或者低挥发性化学信息的探测,不仅如此,Cres OBP10和Cres PBP1在雌虫头部表达量显著高于雄虫,推测其参与雌虫寻找产卵寄主。Cres PBPs在雄虫触角中的表达量极显著高于雌虫,而GOBP尤其是CresGOBP2表现出显著的雌虫触角高表达特征,暗示了PBPs主要参与雄虫识别雌虫释放的信息素,GOBP2不仅参与植物挥发物识别,也可能参与雌虫产卵过程中信息素识别。3.对仁扇舟蛾6个CSP基因进行克隆和序列分析,结果表明6个CSP基因完整序列均含有4个保守的半胱氨酸位点,符合C1-X6-8-C2-X18-19-C3-X2-C4通式,是典型的化学感受蛋白家族;利用q RT-PCR对仁扇舟蛾6个CSP基因进行各虫态表达谱分析,发现CSP4和CSP5在1龄时期高表达,CSP1和CSP2在1～3龄期间高表达,CSP3在3～4龄期间高表达,此阶段仁扇舟蛾开始分散取食且食量突增,因此推测这一阶段高表达的基因参与昆虫的寄主识别;CSP6在卵期显著高表达,推测其参与生长发育等非嗅觉行为;在成虫阶段,除了CSP6以外,其它CSP基因均在羽化后3～4天达到表达量高峰,与交配高峰期相吻合,暗示CSP基因参与求偶或交配过程中的性信息素识别;组织表达谱分析,发现CSP基因主要在触角中大量表达,部分CSP基因在头、翅、足中表达,CSP1、CSP4、CSP5和CSP6在雌虫触角中的表达量显著高于雄虫,CSP2和CSP4在雄虫翅中表达量较高,CSP3则在雄虫足上的表达量高于雌虫,进一步说明了CSP功能多样性。4.原核表达获得重组蛋白CresGOBP2,Western Blot分析表明组织提取总蛋白在15～18 k Da出现清晰的单一条带,说明蛋白纯化质量较高;荧光竞争结合实验发现,CresGOBP2与供试的29种气味物质结合谱很窄,仅与（E）-2-庚烯醛、反式-2,4-癸二烯醛、苯甲酸、β-紫罗酮、邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二异丁酯6种气味物质具有结合能力,与邻苯二甲酸二丁酯（Ki=10.92μM）和邻苯二甲酸二异丁酯（Ki=9.75μM）结合能力最强。5.通过同源建模和分子对接手段对仁扇舟蛾气味结合蛋白和包含1-NPN在内的6个配体进行互作分析,结果表明2个CresGOBP均与家蚕（Bombyx mori）GOBP2蛋白结构相似度最高（48.57%和79.43%）,对所得模型综合评估发现,2个CresGOBP蛋白结构均合理,对CresGOBP与5种气味物质和荧光探针进行蛋白-配体互作分析,结果显示CresGOBP1和GOBP2都与1-NPN具有一定结合能力（Total score>4.0）,与2个CresGOBP docking得分最高的配体均为邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二异丁酯（Total score>6.5）,CresGOBP1与邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯、（E）-2-庚烯醛CScore得分最高（Cscore=5）,CresGOBP2与β-紫罗酮CScores得分最高（Cscore=5）。CresGOBP1和CresGOBP2CresGOBP1在与各配体对接过程中,均由第9位苏氨酸（THR 9）和第37位色氨酸（TRP 37）以及第56位丝氨酸（SER 56）于配体形成氢键,初步判断以上三个氨基残基是CresGOBP与气味分子互作的关键氨基酸位点。6.对14种挥发性化学物质进行雌、雄虫触角电位实验,结果表明仁扇舟蛾成虫对（E）-2-庚烯醛、顺-3-己烯醇、己醛、顺-3-己烯酯、2-羟基苯甲醛、反式-2,4-癸二烯醛反应较强;雌、雄虫触角对大多数小分子量的醛、醇和酯类有生理活性,推测这类物质在仁扇舟蛾的寄主定位中起重要作用;雌虫对0.2μg/μL邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯和（E）-2-庚烯醛的触角反应显著高于雄虫,这与荧光竞争结合及分子对接实验结果一致,从电生理水平进一步验证CresGOBP2的结合特性。