背景及目的A型流感病毒（influenza A virus，IAV）可引起广泛的动物感染，特别是禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）能引起家禽类以急性致死性为主要特征的烈性传染病，常导致全群覆灭，给养禽业造成毁灭性打击。IAV亚型众多，且在流行中极易发生变异，它可在短期内突然发生，起病急、蔓延快，往往造成不同程度的流行，甚至造成世界性大流行。故而WHO将流感作为第一个实行全球监测的疾病。进入21世纪，禽流感似乎在全球愈演愈烈，使人类处于其危害的阴影之中。人类生存环境中大量存在着禽流感病毒，人类的生产生活活动增加了感染禽流感的机会。因而流感病毒的监测凸显出愈来愈重要的地位和作用。流感监测最主要的目的是为了及时发现并抓住有意义的流感病毒新变种，尤其是大流行株，用于诊断试剂的制备、疫苗的生产及疫情预报。流感病毒诊断中最重要的方法就是病毒的分离鉴定，目前国内常规流感病毒检测采用鸡胚、细胞培养分离病毒、血凝实验（Hemagglutination assay，HA）及血凝抑制试验（Hemagglutination Inhibition test，HI test）确定型与亚型。近几年，随着禽流感的频繁暴发以及跨种属传播的加剧，人们认识到需要研究一种可在流感大流行时快速、大量生产流感病毒的细胞培养系统。但报告的用于流感病毒接种和传代的细胞系仍较少，能够支持流感病毒复制增殖的原代细胞和连续细胞系数目是有限的。故进一步寻找对流感病毒敏感的细胞具有重要意义。流感病毒主要是通过血凝素（HA）与宿主细胞表面受体识别结合而粘着到细胞表面，进而入侵细胞的。禽源性和人源性的流感病毒HA受体结合特点各有不同，从而决定了病毒的宿主范围，人流感病毒倾向于结合NeuAa-2,6-Gal（2-去氧-N-乙酰基神经氨酸-6-半乳糖）受体，禽流感病毒则倾向于结合NeuAa-2,3-Gal（2-去氧-N-乙酰基神经氨酸-3-半乳糖）受体。一般认为禽流感病毒会较稳定的存在于野禽类，但是近几年来禽类病毒不断使家禽类受到大面积感染，甚至打破种属屏障引起人或其他哺乳动物感染，且有些病例提示人——人传播的可能性已经存在。由此可见，为了更加适应新的宿主——人，病毒在各方面不断发生变化。搞清这些流感病毒的变异和病毒如何选择物种以及如何跨越物种而流行的分子机制，对预防和控制新型流感的爆发是非常重要的。本实验选用来源于人肺泡Ⅱ型上皮，稳定传代的连续细胞系A549细胞作为研究对象。接种不同亚型的A型流感病毒，使用血清学试验和病毒定量试验，检测病毒的毒力及在细胞中的增殖能力，与目前常用流感病毒分离鉴定细胞系MDCK（Madin-Darby canine kidney）细胞进行比较，看A549细胞是否适合作为流感病毒分离鉴定细胞系。此外，通过定性研究的方法，检测A549细胞中NeuAa-2，3-Gal、NeuAa-2,6-Gal两种受体的分布情况，分析A549细胞是否可以为流感病毒跨种属传播的研究提供更好的细胞模型。材料和方法选取本实验室提供的7株A型流感病毒株，人类病毒2株（H1和H3亚型），禽类病毒5株（H1、H3、H7、G1和G9亚型），均已测序明确，依据预试验结果，选取病毒株的原始血凝效价均较高，禽类病毒株大于512，人类病毒株大于128。将各亚型病毒株依据原始滴度按一定比例稀释，分别接种于A549细胞和MDCK细胞后采用一系列病毒血清学和病毒定量试验，将两者结果进行比较分析。使用定性研究的方法，检测A549细胞中的受体分布情况。①观察病毒增殖各种指标的变化，即不同时段倒置显微镜下观察细胞病变效应（Cytopathic effect，CPE）。病毒血清学试验，血凝试验检测VGM中血凝活性，测定病毒的增殖感染能力；②空斑形成试验。计数不同稀释度病毒形成的空斑数，以空斑形成单位（Plaque forming unit，PFU）表示病毒的感染滴度，检测病毒在细胞中的增殖能力；③50％组织培养细胞感染剂量法（TCID50），计算结果，测定病毒稀释度，检测细胞对于病毒的敏感程度；④使用生物素以及荧光标记的植物性凝集素MAA和SNA，分别特异性针对NeuAa-2,3-Gal和NeuAa-2,6-Gal受体。染色后镜下观察A549细胞中两种受体分布情况。结果1．各亚型A型流感病毒在A549细胞中培养至36小时血凝效价最高，同时可见明显CPE。在MDCK细胞中培养至72小时血凝效价最高，出现明显CPE的时段与HA效价最高时段基本相符，但是滴度均较原始滴度有不同程度的下降，这也验证了使用MDCK细胞，容易导致病毒滴度下降的说法。A549细胞中HA滴度下降的更明显，最高下降率可达98.3％，且禽类病毒下降率要高于人类病毒。2．空斑形成试验结果。选择MOI 0.1的H1N1亚型（DK／ST／1734／2003）流感病毒，依据公式：空斑形成单位（pfu／ml）=（每孔平均空斑数×病毒稀释度）／每孔病毒接种量（ml），计算结果。MDCK细胞中每孔接种1ml 10^-6的病毒液，平均空斑数75个，PFU=7.5×10⁷。A549细胞中每孔接种1ml 10^-4的病毒液，平均空斑数12个，PFU=1.2×10⁵。3．TCID50结果。依据Karber公式log TCID50=L-d（s-0.5）计算。A549细胞中滴度T1=3×10⁷TCID50／ml，MDCK细胞中滴度T2=4×10⁹TCID50／ml。4．A549细胞中受体分布情况。生物素标记的MAA和SNA，镜下可见MAA着色细胞明显多于SNA着色细胞，说明A549细胞中MAA结合的NeuAa-2,3-Gal受体要多于SNA结合的NeuAa-2,6-Gal受体。FITC标记的MAA在荧光显微镜下发出黄绿色的荧光，TMRITC标记的SNA镜下发出橙红色的荧光，结果显示黄绿色荧光略强于橙红色荧光，但是差异不明显。结论1．病毒感染后的A549细胞维持液中的病毒效价明显降低，虽然能出现明显细胞病变，但不能在该细胞内有效的增殖复制。A549细胞对于流感病毒是中低度敏感细胞。2．A549细胞中每接种1ml病毒液病毒做10^-5的稀释可以形成空斑，而MDCK细胞中接种等量病毒形成空斑，需要稀释10^-7。同一株病毒在MDCK细胞中的增殖能力要强于A549细胞。3．A549细胞中病毒接种所需稀释度要高于MDCK细胞，说明同一株病毒在MDCK细胞中增殖的能力要强于A549细胞。4．A549细胞中NeuAa-2,3-Gal受体占多数，明显多于NeuAa-2,6-Gal受体，主要是以禽类病毒结合的受体为主。