第一部分纳米碳在腹腔镜早期远端胃癌根治术中的应用研究背景胃癌是临床上常见的恶性肿瘤之一,是胃恶性肿瘤中最常见的类型。从流行病学角度看,胃癌的发病率表现出明显的地域差异,东亚各国远高于欧美国家,这其中又以中、日、韩三国为重,世界上罹患胃癌的患者中有一半都来自我国。从地域上看,我国的西北地区和东部沿海区域是高发区,这与上述地区的生活和饮食习惯密不可分,如熏烤、腌制品和肉食为主的饮食结构等。胃癌起源于胃的黏膜上皮,绝大多数属于腺癌,可发生于胃的任意部位,其中有超过半数发生于胃窦部位。胃癌早期缺乏特异性症状,使其很容易被误诊或漏诊,延误诊治。从预后角度来看,胃癌总体的5年生存率仍然较低,中国、美国、德国、法国的数据均处于200%-30%。早期胃癌患者规范手术后的5年生存率可高达90%-95%,而进展期胃癌患者的5年生存率仅仅为10%-20%。即使是早期胃癌,其淋巴结中癌细胞转移率也接近200%,可见不论早期胃癌还是进展期胃癌,淋巴结转移情况都是决定患者预后最重要的指标之一。因此,术中干净彻底的区域淋巴结清扫是手术成功的重要前提。根据新版日本《胃癌处理规约》和《胃癌治疗指南》的要求,推荐病理学检查的淋巴结要在15个以上。且早期胃癌的治疗规范认为:切除2/3到3/4的胃再加行D2淋巴结清扫,是安全合理的治疗方式,可以在保证治疗效果和5年生存率的同时,不会明显增加并发症的概率。扩大根治术不管是手术并发症还是术中死亡率及术后并发症都较高,盲目的扩大根治术,并不能带来更高的5年生存率,准确判断淋巴结是否有癌细胞转移显得至为重要。选择一种有效的方法来准确判定淋巴转移的状态,不但对根治性手术有极大的指导性意义,而且会直接影响患者的预后情况和后续辅助治疗方案的制定。我们常用的检测方式如血清肿瘤标记物、超声、CT、磁共振乃至PET-CT均缺乏敏感性和准确性。术中判断淋巴结是否为转移性淋巴结也过多依赖术者的主观感觉和临床经验,因此,如何准确快速地评估区域淋巴结转移情况,在保证肿瘤细胞清扫彻底的同时又能减少不必要的创伤及并发症,一直是临床研究的热点问题。纳米碳淋巴示踪剂作为第3代的示踪产品能清晰地显示淋巴引流的路径,从而令胃癌手术的淋巴清扫变得更加准确和有针对性,逐步得到了临床的一致认可。纳米碳淋巴示踪剂具有极强的淋巴亲和性,医生不必担心其会进入毛细血管,从而进入血液循环系统;而且,纳米碳制剂也并不容易进入组织间隙内。此外,由于纳米碳微颗粒有较好的淋巴结趋向性和聚集性,因此很容易沉积在其所经之处的淋巴结内,实现淋巴结的黑染。这对于需要准确和彻底清扫区域淋巴结的胃癌手术来说是意义巨大的,特别是对于肿瘤定位困难的早期胃癌的腹腔镜手术来说。纳米碳的视觉标记作用不但可以清晰地显示肿瘤的位置及大致的两侧边界,还可以将区域淋巴结染色帮助淋巴结的清扫,这显然对手术时间的缩短及减少手术创伤都有很大的帮助。随着我国消化道肿瘤早癌筛查的全面普及,胃癌的早诊早治率均有明显提升。也因此,临床上越来越多的早期胃癌患者接受了手术治疗,而腹腔镜手术的飞速发展,也令腹腔镜胃癌根治术逐渐普及。目的研究应用纳米碳在腹腔镜早期远端胃癌根治术中的意义,进一步探讨通过纳米碳染色定位前哨淋巴结来评估区域淋巴结转移状态从而指导区域淋巴结清扫范围的可行性及效果。资料与方法1.研究对象回顾性分析了我院2013年1月至2018年10月间通过“消化道早癌筛查项目”选出的186例早期远端胃癌患者(均行腹腔镜远端胃癌D2根治术)的临床资料。入组标准为:经电子胃镜及病理诊断确诊为胃癌,且经超声内镜检查显示癌组织局限于黏膜层或黏膜下层(即早期胃癌);病灶为单发,无远处转移(MO)或合并其他部位肿瘤的情况;术前未行EMR(内镜下黏膜层切除术)或ESD(内镜下黏膜下层切除术);排除了穿孔或梗阻等不宜行腹腔镜手术的病例;术前行胸腹部联合强化CT扫描排除肝肺骨等远处转移灶;肿瘤周围磁共振扫描未浸润周围组织器官;患者既往无肿瘤病史,无腹部重大手术史及外伤史;术前均未行辅助放化疗;无心、肺、肝、肾等重要器官功能障碍及其他手术禁忌症;无麻醉禁忌症,ASA评分Ⅰ-Ⅲ级。2.染色方法研究组均在术前24小时经电子胃镜于肿瘤周围胃黏膜下分上下左右3-4个点注射,注射时应注意刺入后在黏膜下潜行推进约5mm后再缓慢推注,用量约0.15-0.2毫升/点,为防止拔针后纳米碳外渗,拔出针头前应常规回抽少许纳米碳示踪剂。3.手术及淋巴结的挑选两组患者的手术均由熟练掌握腹腔镜远端胃癌根治术(D2)手术技术的同一手术团队完成,均施行5孔法腹腔镜微创手术。淋巴清扫范围包括:D1淋巴结清扫(包括第1组、第3组、第4sb组、第4d组、第5组、第6组、第7组淋巴结的清扫)的基础上,加行第8a组、第9组、第11p组、第12a组的淋巴结清扫。术中于镜下仔细观察研究组患者区域淋巴结的黑染效果,记录研究组与对照组清除2站淋巴结耗费的总时间。研究组的标本中我们将发生黑染的且距离胃肿瘤最近的淋巴结定义为前哨淋巴结(SLN)并单独装袋送检,再依次挑出黑染的其他各组淋巴结后分别检出,并记录淋巴结所属的分组及站数,最后再采用肉眼加手感触摸的方法,挑出未黑染但可以触摸到的淋巴结,按上述方法归类计数;对照组的标本我们直接采用肉眼加手感触摸的方法尽可能检出所有淋巴结。,为提高本次研究的淋巴结检出率,我们还在苏木精伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色的基础上使用了连续切片加免疫组化的方法,以尽可能增加微小淋巴结的检出率。4.主要统计指标评估使用纳米碳在手术时间、术中淋巴结清扫效率及术后检出淋巴结数量等方面的意义,以及在腹腔镜胃癌手术中通过定位前哨淋巴结并活检来评估早期胃癌区域淋巴结转移情况的成功率、准确性、灵敏性及特异性等做初步研究。结果1.研究组术中纳米碳淋巴示踪剂对胃癌周边区域的淋巴结黑染效果良好,成功率达到了 100%。同时周围的网膜组织及脂肪组织却并不会发生黑染的现象,证明纳米碳不会妨碍术者对解剖层次的分辨从而影响手术操作。2.研究组的患者手术总时间略快于对照组,但差异并不大。3.研究组平均淋巴结检出数明显高于对照组;研究组的微小淋巴结(直径5mm以下)检出数1833枚也明显高于对照组的778枚;研究组的微小淋巴结(直径5mm以下)检出率为60.9%,同样显著高于对照组的43.29%;研究组的淋巴结转移率16.3%与对照组的淋巴结转移率15.69%相比,无明显差别。4.纳米碳制剂示踪早期胃癌前哨淋巴结以评估区域淋巴结转移情况的敏感度为91.6%;特异度为:100%(83/83);准确度为:98.9%(94/95);阳性预测准确度为:100%(11/11);阴性预测准确度为:98.8%(83/84)结论在腹腔镜早期远端胃癌根治术中使用纳米碳制剂不仅有助于腹腔镜术中对早期较小肿瘤的定位,还可以指导术者于术中在保证将转移淋巴结清扫彻底的基础上,尽量减少清扫范围以最大限度降低不必要的损伤;此外,通过切除纳米碳染色定位的前哨淋巴结活检来评估区域淋巴结是否伴有癌细胞转移是可行的,有良好的应用前景。第二部分纳米碳在腹腔镜结直肠癌(cT1期)根治术中的应用研究背景结直肠癌(Colo-rectal cancer)为源自结肠及直肠的癌症,也称为大肠癌,是我国非常常见的癌症类型。在西方发达国家,结肠癌和直肠癌也是最常见的癌症之一,它是导致癌症死亡的第二位原因。大肠癌的发病率从40岁开始明显增加,约60-75岁达到高峰。随着我国经济和社会的不断发展,以及自然环境的变化和饮食习惯的逐渐改变,我国大肠癌的发病率和死亡率必将继续攀升。从基因角度看,结肠癌与直肠癌主要的差异仅仅是在解剖位置上存在差异。从病理学角度看,几乎所有的结肠癌和直肠癌都是腺癌,它们一般发生于结肠和直肠的黏膜。结直肠癌一般初始表现为结肠或直肠黏膜层的隆起,肿瘤继续生长,逐渐侵犯肠壁的其他层次,附近的淋巴结同时也被侵犯,随着肿瘤的进一步进展,大肠癌在区域淋巴结转移后通常很快转移至肝脏,成为预后较差的晚期肿瘤。因此,对于结直肠癌患者来说,想获得一个较好的预后,早诊早治是唯一可行的机会。大量研究已经证实:早期结直肠癌很少出现远处转移,其区域淋巴结转移率也较低,因此对于早期结直肠癌(cT1期)患者来说,接受根治性手术后一般预后良好。在我国,早期大肠癌5年生存率在90%以上,其中“黏膜内癌”的患者5年生存率更是达到了 95%以上;相反,对于进展期大肠癌来说,尽管经过术前辅助放化疗,标准的根治术手术及术后的辅助放化疗等一系列规范治疗,其治疗效果仍差强人意,5年生存率仅为31%[3]。目前治疗结直肠癌的主要方式是以根治性手术切除为核心的综合性治疗,不论是采用开腹手术还是腹腔镜手术,根治性的手术切除都是治愈结直肠癌的首要条件。由于结直肠癌的主要转移方式是淋巴转移,特别是进展期的结直肠癌,往往伴有区域淋巴结的转移。因此不论是早期结直肠癌还是进展期结直肠癌,淋巴清扫的彻底与否都与结直肠癌手术的质量密切相关。但是,对于早期结直肠癌患者如果常规行广泛的区域淋巴结清扫术,不但会增加手术的创伤及术后并发症的发生率,也会影响患者术后的生存质量[4]。可见,能否选择一种适当的方式来准确判定淋巴转移的状态,不但对根治性手术有极大的指导性意义,而且会直接影响患者的预后情况和后续辅助治疗方案的制定。但遗憾的是,目前临床上对于结直肠癌区域淋巴结的转移情况的评估,还缺乏准确可靠的的手段。我们常用的检测方式如血清肿瘤标记物、超声、CT、磁共振乃至PET-CT均缺乏敏感性和准确性。术中判断淋巴结是否为转移性淋巴结也过多依赖术者的主观感觉和临床经验,参考价值也并不是很高。因此,如何准确快速地评估区域淋巴结转移情况,在保证肿瘤细胞清扫彻底的同时又能减少不必要的创伤及并发症,一直是临床研究的热点问题。前哨淋巴结(Sentinel lymph node,SLN)是指原发性肿瘤淋巴引流的第一站淋巴结(可以是一个或多个)。也是早期(T1)结直肠癌患者最常出现淋巴转移的位置,一般来说,恶性肿瘤的癌细胞在淋巴系统内会按照第一站、第二站、第三站的顺序转移,不会出现跳跃式转移的状况。正确判断前哨淋巴结的转移情况,就可以对恶性肿瘤的区域淋巴转移做出较正确的判断,在清扫彻底的基础上,也可避免不必要的扩大清扫带来的并发症风险。因此,如何来准确地定位前哨淋巴结(SLN)是手术成功与否的关键一环。纳米碳淋巴示踪剂能清晰的显示淋巴引流的路径,从而将癌症手术的淋巴清扫变得更加简单便捷。T1期患者前哨淋巴结评估准确度可高达98.3%-100%,T2期患者前哨淋巴结评估准确度骤降到52.4%-80%。因此cT1期的结直肠癌患者显然更适合进行纳米碳的应用研究。目的研究应用纳米碳淋巴示踪剂在腹腔镜结直肠癌(cT1期)根治术中的临床意义,进一步探讨通过纳米碳染色定位前哨淋巴结来评估区域淋巴结转移状态从而指导区域淋巴结清扫范围的可行性及效果。资料与方法1.研究对象选取2013年1月至2018年10月间,在我院普外科完成腹腔镜结直肠癌根治术的早期结直肠癌(cT1期)患者共329例。入组标准:经电子肠镜及病理诊断确诊为结肠癌和直肠癌,且经超声内镜检查显示癌组织局限于黏膜层或黏膜下层(即T1期癌症);病灶为单发,无远处转移(MO)或合并其他部位肿瘤的情况;术前未行EMR(内镜下黏膜层切除术)或ESD(内镜下黏膜下层切除术);直肠癌下缘距离肛缘大于5cm;排除了穿孔或梗阻等不宜行腹腔镜手术的病例;肿瘤直径在8厘米以内;术前行胸腹部联合强化CT扫描排除肝肺骨等远处转移灶;肿瘤周围磁共振扫描未浸润周围组织器官;患者既往无肿瘤病史,无腹部重大手术史及外伤史;术前均未行辅助放化疗;无心、肺、肝、肾等重要器官功能障碍及其他手术禁忌症;无麻醉禁忌症,ASA评分Ⅰ-Ⅲ级。2.染色方法研究组在术中使用5号头皮针自制的注射工具在肿瘤周围肠浆膜下分3-4个点注射,注射时应注意刺入后在浆膜下层潜行推进约5mm后再缓慢推注,用量约0.15-0.2毫升/点,为防止拔针后纳米碳外渗,拔出针头前应常规回抽少许纳米碳示踪剂,随即开始手术。3.手术及淋巴结的挑选所有患者的手术均由熟练掌握腹腔镜结直肠癌根治术手术技术的同一手术团队完成。均施行5孔法腹腔镜微创手术,所有入组患者均严格按照标准的D3根治术原则完成,按全结肠系膜及全直肠系膜切除的原则完全切除肿瘤及其周围组织。术中于镜下仔细观察研究组患者区域淋巴结的黑染效果,记录研究组与对照组清除3站淋巴结耗费的总时间。移除标本后,在体外进行手捡(由参与手术的同一高年资主治医师完成)淋巴结,尽可能获得肉眼加手感可及的所有淋巴结。研究组的标本中我们将距离肿瘤最近的黑染的淋巴结定义为前哨淋巴结(SLN)并单独装袋送检,再依次挑出黑染的三站淋巴结后分别检出,并记录淋巴结所属的站数及个数,最后再采用肉眼加手感触摸的方法,挑出未黑染但可以触摸到的淋巴结,按上述方法归类计数;对照组的标本我们直接采用肉眼加手感触摸的方法尽可能检出所有淋巴结。为提高淋巴结总检出率和微小淋巴结检出率,我们还在苏木精伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色的基础上使用了连续切片加免疫组化的方法。4.主要统计指标评估使用纳米碳制剂在手术时间、术中淋巴结清扫效率及术后检出淋巴结数量等方面的意义,以及通过定位前哨淋巴结并活检来评估cT1期结直肠癌区域淋巴结转移情况的成功率、准确性、灵敏性及特异性等做初步研究。结果1.研究组术中纳米碳淋巴示踪剂对结直肠癌区域的淋巴结黑染效果良好,成功率达到了 100%,同时周围的网膜组织及脂肪组织却并不会发生黑染的现象,证明纳米碳不会妨碍术者对解剖层次的分辨从而影响手术操作。2.研究组的患者手术总时间略快于对照组,但差异无统计学意义。3.研究组人均淋巴结检出数明显高于对照组;研究组的微小淋巴结(直径5mm以下)检出数也明显高于对照组;研究组的微小淋巴结(直径5mm以下)检出率为55.8%,同样显著高于对照组的36.8%;研究组淋巴结检出总数不到12枚的患者为2例(1.6%),显著低于对照组的54例(32.1%)。4.纳米碳制剂示踪早期胃癌前哨淋巴结以评估区域淋巴结转移情况的敏感度为90.47%;特异度为:100%(140/140);准确度为:98.75%(159/161);阳性预测准确度为:100%(19/19);阴性预测准确度为:98.59%(140/142)。结论在腹腔镜早期(cT1期)结直肠癌手术中使用纳米碳制剂不仅有助于腹腔镜术中对早期较小肿瘤的定位,还可以指导术者于术中在保证将转移淋巴结清扫彻底的基础上,尽量减少清扫范围以最大限度降低不必要的损伤;此外,通过切除纳米碳染色定位的前哨淋巴结活检来评估区域淋巴结是否伴有癌细胞转移是可行的,有良好的应用前景。第三部分载氟尿嘧啶纳米碳在腹腔镜胃癌根治术中淋巴靶向化疗的临床研究研究背景胃癌是临床上常见的恶性肿瘤之一,是胃恶性肿瘤中最常见的类型。胃癌在我国各种恶性肿瘤中已高居榜首,死亡率也排名第一。从预后角度来看,胃癌总体的5年生存率仍然较低,处于20%-30%的水平。不论是早期胃癌还是进展期胃癌,淋巴结转移情况都是决定患者预后最重要的指标之一。进展期胃癌手术检出的区域淋巴结中,经病理检测转移率高达70%以上;即使是早期胃癌,其检出的淋巴结中癌细胞转移率也接近20%。经胃癌D2根治术后,早期胃癌患者中黏膜内癌淋巴结转移率达3.7%,而黏膜下癌淋巴结转移率高达25.3%。早期胃癌病灶局限在黏膜内者淋巴结转移概率约2.3%-16.6%,而一旦癌细胞浸润至黏膜下层,淋巴结转移概率会骤增至16.2%-46.8%。因此,术中干净彻底的区域淋巴结清扫是手术成功的重要前提。早期胃癌的治疗规范认为:切除2/3到3/4的胃再加行D2淋巴结清扫,是安全合理的治疗方式,可以在保证治疗效果和5年生存率的同时,不会明显增加并发症的概率。但是不论是胃癌RO切除术还是D2淋巴清扫,大部分情况下,我们仅能把肉眼可见的肿瘤及其转移灶清除,对于肉眼无法识别的癌细胞是非常容易遗漏的。因此,国际上公认的胃癌的规范治疗是以根治性手术为核心以术后化疗为辅助的综合治疗。但是考虑到全身性静脉化疗明显的毒性反应,广大临床医师对化疗的时机和方法的选择也几经变迁。局部缓释化疗、间质化疗、淋巴靶向化疗等等方法都见诸报道,从统计数据看都取得了令人欢欣鼓舞的疗效,这其中淋巴靶向化疗的效果尤其突出。5-氟尿嘧啶作为经典的胃肠道肿瘤化疗药物,其疗效早已得到了广泛认可,但不可否认的是其全身毒性作用还是比较明显的。我们试图找到一种能将氟尿嘧啶注射液精准带到所需部位并能缓慢释放的给药系统。通过对纳米碳混悬液的研究及查阅部分研究资料,我们发现纳米碳混悬液是一种适宜的化疗药物缓释载体,可以完成这一设想。目的研究使用载5-氟尿嘧啶纳米碳混悬液在腹腔镜胃癌根治术中进行淋巴靶向化疗的安全性和有效性;对比术中淋巴靶向化疗联合全身静脉化疗与单纯使用全身静脉化疗的差异。资料与方法1.研究对象选取2015年4月至2016年5月间,在我院普外科完成腹腔镜远端胃癌根治术(D2)的胃癌患者共68例。将所有患者随机分为两组,研究组33例患者首先在术中使用载氟尿嘧啶纳米碳混悬液行淋巴化疗,术后1个月按XELOX方案(卡培他滨+奥沙利铂)行化疗。对照组35例患者均未行术中化疗且未使用纳米碳示踪剂,术后1个月按XELOX方案(卡培他滨+奥沙利铂)行化疗。两组患者的一般情况及病理分期及肿瘤位置均无明显统计学差异。2.实验方法使用前预先将氟尿嘧啶注射液与纳米碳注射液混合后充分震荡10分钟备用,每次使用前均应充分震荡10分钟,以保证氟尿嘧啶与纳米碳充分接触,散布均匀。研究组的33例患者均在术前24小时经电子胃镜将载5-氟尿嘧啶纳米碳混悬液在肿瘤周围的胃黏膜下层分6个点注射,注射时应注意以斜30度刺入后在黏膜下层潜行推进约5mm后回抽无回血,再缓慢推注,用量约0.25毫升/点,为防止拔针后纳米碳外渗,拔出针头前应常规回抽少许载氟尿嘧啶纳米碳混悬液,整个注射时间应在3分钟内完成。两组患者的手术均由熟练掌握腹腔镜远端胃癌根治术(D2)手术技术的同一手术团队完成。3.主要统计指标对比研究组和对照组手术时间和术中出血量的差异;对比研究组患者术前1天和术后1、3、5、7天下列指标的变化情况:外周血白细胞计数(WBC)、血红蛋白(HGB)、血小板(PLT)、总胆红素(TBiL)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酐(Cre)、尿素氮(BUN);对比研究组和对照组术后拔除引流管时间、胃肠功能恢复时间、术后两周内并发症(切口感染、吻合口出血、吻合口瘘及其他内科并发症等)情况;术后1个月按XELOX方案行第1次化疗,对比研究组与对照组患者化疗前1天和化疗结束后第1天的外周血白细胞计数(WBC)、血红蛋白(HGB)、血小板(PLT)、总胆红素(TBiL)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酐(Cre)、尿素氮(BUN);随访对比研究组和对照组的肿瘤复发情况,分别统计术后3个月、6个月、12个月及24个月的数据。结果载5-氟尿嘧啶纳米碳混悬液应用于腹腔镜远端胃癌根治术中,不会增加手术时间和术中出血量,虽然可能导致胃肠功能恢复时间延长,但并不会增加术后并发症的发生几率。从术后随访结果看,应用载5-氟尿嘧啶纳米碳混悬液行淋巴化疗的研究组患者2年以内的早期复发率是低于对照组的。结论载氟尿嘧啶纳米碳混悬液应用于腹腔镜远端胃癌根治术中化疗,不会增加手术时间和术中出血量,从手术操作的角度看是安全的;通过对比研究发现载药纳米碳局部化疗的全身毒性反应较轻,与对照组从骨髓移植和肝肾功能损害的角度对比几乎没有差异,是安全的;从术后2年的随访结果看,通过增加载氟尿嘧啶纳米碳混悬液术中淋巴化疗的研究组复发率是低于对照组的,证明载,药纳米碳化疗是有效的。因此,纳米碳在胃癌的淋巴化疗中具有广阔的应用前景。