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红花草莓(Red-flowered strawberry)是草莓家族的新成员,为属间杂种,其红花性状是由开红花的沼委陵菜(Potentilla palustris)利用远缘杂交的方式导入至白花栽培草莓(Fragaria×ananassa)中去的。相比传统栽培草莓而言,红花草莓不仅具有丰富的营养价值,而且具有良好的观赏价值。其花红果艳,能够应用于园林绿化和盆栽观赏,是一种新型的兼具观赏和食用的草莓,具有很好的发展潜力。花青素苷是红花草莓得以呈现红色的物质基础,本研究以红花草莓品种‘四季红’为试材,选取了红花草莓花瓣发育过程中具有明显颜色变化的三个发育时期,即蕾期(PF_L)、转色期(PF_Z)、大蕾期(PF_D)的花瓣样品,构建了9个小RNA文库(PF_L1、PF_L2、PF_L3、PF_Z1、PF_Z2、PF_Z3、PF_D1、PF_D2、PF_D3)和1个混合样品的降解组文库(PF)。通过应用高通量测序技术挖掘参与红花草莓花瓣发育过程中的miRNAs,重点发现能够参与花青素苷生物合成调控的miRNAs。利用TargetFinder软件及降解组测序技术对红花草莓小RNA测序获得的miRNA进行靶基因的预测和验证。此外,通过应用geNorm和NormFinder等程序对qRT-PCR定量的结果进行分析,筛选出适合用于红花草莓miRNA表达水平相对定量的表达稳定的内参基因,为红花草莓花色相关miRNAs的进一步研究奠定基础。主要结果如下:(1)9个小RNA文库(PF_L1、PF_L2、PF_L3、PF_Z1、PF_Z2、PF_Z3、PF_D1、PF_D2、PF_D3)通过小RNA测序技术得到的原始Total reads数分别为1.70×10~7、1.59×10~7、1.47×10~7、1.27×10~7、1.27×10~7、1.46×10~7、1.18×10~7、1.26×10~7和1.32×10~7条。共鉴定到1,703个miRNAs,其中665个miRNAs在9个样品小RNA文库中均存在。在3个不同发育时期的花瓣中共鉴定到317个显著差异表达的miRNAs,其中有127个miRNA的差异程度达到了极显著水平。(2)通过降解组测序,在PF文库得到2.37×10~7条原始reads。当去除掉3’接头序列后,发现PF降解组文库中可以匹配到草莓基因组上的reads为2.34×10~7条,目前草莓已注释的转录本数量为39,487个,降解组文库PF能够匹配到草莓已注释转录本数为34,202个,占已注释草莓总转录本的比例为86.26%。应用TargetFinder软件进行miRNA的靶基因预测,结果显示1365个miRNA对应的14,406个靶基因。利用Cleaveland软件对降解组测序数据与转录组数据进行降解位点的检测,共检测到了166个miRNA对应的227个靶基因发生降解。进一步分析发现,在miRNA-靶基因对中,有超过80%的miRNA对应多个靶基因,单个miRNA对应靶基因的数目从2到26个不等,只有12个miRNA分别只对应1个的靶基因。此外,还发现普遍存在单个靶基因受控于多个miRNA调节的情况。这表明miRNA与靶基因之间存在着复杂的调控网络。(3)应用geNorm、NormFinder和Bestkeeper软件对8候选miRNA的内参基因进行稳定性评价。3款软件评价结果表明,mdm-miR11004是红花草莓花色相关的miRNA实时荧光定量的最适候选内参基因,bdi-miR159a是在红花草莓所有组织样品中表达最不稳定的内参基因。(4)通过对miRNA、转录组和降解组测序数据进行联合分析,初步筛选得到了33个和红花草莓花色形成相关的候选miRNAs和其对应的40个靶基因。并选择了8个花色相关的候选miRNA在不同颜色红花草莓花瓣中进行qRT-PCR表达特性分析。初步获得了可能通过负调控的模式参与到花色的调控中2个miRNA及其对应的靶基因,即mdm-miR159d与靶基因NCL1和csi-miR156f-p5与靶基因SPL13和MYB44。这2个miRNAs在红花草莓花青素苷的生物合成中可能具有重要的作用。